[发明专利]一种固定化酶及其制备方法与在OPO制备中的应用

说明书

本发明公开了一种固定化酶及其制备方法与在制备OPO中的应用。本发明所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：将磁性载体和脂肪酶分散在磷酸缓冲液中形成反应液，将反应液在20～60℃下反应1～6h，得到所述固定化酶；所述磁性载体为多巴胺修饰的铁酸锌。本发明将铁酸锌磁性颗粒作为磁性核心，利用多巴胺对铁酸锌表面进行修饰得到所述磁性载体，通过共价结合将脂肪酶固定在磁性载体表面，得到固定化酶，并将其用于催化合成OPO中，OPO的转化率可高达38％。本发明所述固定化酶，具有优异的稳定性，良好的催化能力，改善了脂肪酶的热稳定性，对婴儿配方奶粉中添加剂的合成起到重要作用。

技术领域

本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法与在制备OPO中的应用。

背景技术

酶是催化生物和化学反应的一种蛋白质，具有催化活性高、选择性强、专一性好、成本低、反应条件温和以及可被生物降解等优点。因此酶在精细化学、药物化学、食品或能源等各个领域都有很高的应用。生物催化过程作为一种合理、高效的转化方法受到了广泛的关注。酶促工艺在支持可持续绿色化工中的发挥了重要作用。然而，天然酶在实际应用中普遍操作和储存稳定性较差、酶的回收和重复利用困难、成本高，而且还会受到反应液的影响。因此，固定化在酶催化中是常用的改善方法。

在实际应用中，固定化酶在稳定性、生物催化剂负载、可回收性等方面具有优势。固定化是成功实现以酶为基础的工业过程的关键技术，特别是用于生产绿色和可持续能源或生物衍生的催化转化化学品(工业化)。酶的固定化可以改变酶的活性、特异性或选择性，这为增加酶在底物上的可用性提供了一个良好的基础。如今，多巴胺仿生修饰磁性纳米材料已经被开发为制备酶固定化载体的便捷方法了。

磁性纳米材料主要是因为其具有比表面积，而且能通过外加磁场轻易地回收重复使用，从而优化了操作成本，提高了产品的纯度。磁性纳米材料通常不会直接用作酶的固定化载体，会与其他一些材料，如高分子聚合物、介孔硅、氧化石墨烯等材料，形成不同的磁性复合材料，以此作为固定化载体。Mosayebi等以辛基官能化的磁性氧化石墨烯纳米复合材料(GO-Fe₃O₄)为载体，对VII型念珠菌脂肪酶(CRL7)进行固定化。实验结果表明相对于游离酶(34.5U·mg-1脂肪酶)，固定在此载体上的脂肪酶具有94.7％的酶活保留率，酯交换反应的转化率为89％，在10个循环后保留的活性为63％。Zhou等研究合成一种简单的核壳磁性COF复合材料(Fe₃O₄@COF-OME)，以其为载体对RML(根茎脂肪酶)进行固载，应用在生物柴油生产中。结果表明，该方法合成载体材料具有外在的磁性，能很好地分散在水介质中，并能促进脂肪酶的附着。Fe₃O₄@COF-OME磁性核壳结构不仅很大程度上保持了脂肪酶的活性，而且具有较高的固定化效果和回收利用效果。在优化条件下以麻疯树油为原料，生物柴油的转化率约为70％。

多巴胺(DA)是一种典型的儿茶酚胺类有机化合物，其结构与贻贝蛋白的基本粘附成分相似，可以作为材料表面改性剂。DA可以在碱性条件下(pH7.5)以氧气为氧化剂自聚成聚多巴胺(PDA)，从而在几乎所有有机和无机材料表面上形成具有可控制的厚度和良好粘合性能的纳米级PDA膜，使其成为一种多功能的涂料。而且，PDA的化学结构中存在许多官能团(例如胺，亚胺和邻苯二酚)，使其很容易通过与官能团的共价键合而将生物大分子固载在其表面。多巴胺几乎可以充当所有有机、无机材料的表面改性剂，因而在修饰功能化酶载体方面具有广泛的应用。多巴胺修饰载体材料后可以通过温和的条件、简单步骤将酶固定起来。Ariaeenejad等用磁铁矿纳米颗粒和多巴胺对纤维素纳米晶(CNCs)进行功能化，制备出用于共价结合固定化水解酶混合物(三种纤维素酶，两种半纤维素酶及其组合)的纳米载体(DA/Fe₃O₄ NPs@CNCs)。实验结果显示该固定化酶具有更高的最佳温度更高的热稳定性，以及最佳pH向碱性的转变。共价结合可以成功抑制酶的浸出，并提供多达10个循环后仍能轻松回收再利用，初始活性可达50％以上。