[发明专利]一种人参干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用一步法培养人参不定根，包括：将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根；

所述不定根诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.075-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基；

（2）取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；

（3）分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；

所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4 mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；

（4）继代培养：挑取部分（3）获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；

所述干细胞继代培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/L WPM培养基；

（5）液体培养：将（4）获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞；

所述干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/L WPM培养基。

2.根据权利要求1所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5 mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L 蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。

3.根据权利要求1所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L 蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8 g/L WPM培养基。

4.根据权利要求1所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（3）和（4）中，在20-25℃下黑暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团。

5.根据权利要求1所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L 蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8 g/L WPM培养基。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（5）中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培养，3-5周传代一次。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤（2）中，取（1）中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。

8.根据权利要求1-5任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述人参选自野山参，移山参，林下参，园参。

9.根据权利要求8所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述人参为野山参。