[发明专利]糖蛋白N-糖链分析方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种糖蛋白N‑糖链分析方法。该方法包括：a)将待分析糖蛋白用2‑甲基嘧啶硼烷及二硫键还原剂进行蛋白展开变性及二硫键还原处理；b)将步骤a)处理后的蛋白烷基化处理，N‑糖苷酶F酶切；c)将酶切好的样品干燥后使用标记物标记并根据所述标记物对N‑糖链进行分析；所述标记物为普鲁卡因酰胺和/或其盐。该方法可显著缩短操作流程，增加检测通量，且更为环保易用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种糖蛋白N-糖链分析方法。

背景技术

在重组蛋白的生产过程中，培养条件等条件因素会影响细胞蛋白质的翻译后修饰水平，其中糖基化(glycosylation)是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一，对蛋白质生物学功能的发挥起着至关重要的作用，如蛋白质折叠、细胞识别、癌细胞转移、薄膜保护作用、血型决定系统、物质转运等。

生物体中最常见的糖蛋白是N-糖苷键型糖蛋白，即寡聚糖与肽链上的天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰的蛋白。N-糖链在整个糖蛋白中只占很小的一部分，但是对整个糖蛋白的性质影响巨大，所以N-糖糖谱分析在工艺开发、剂型开发和稳定性测试等过程中均为重要的质控指标。

在常规的分析过程中，经过化学手段或酶切释放寡糖链，对游离N-糖的研究，其中对酶切游离后N-糖链的研究也是最简单、高效的方法。目前，N-糖链主要是使用N-糖苷酶将糖蛋白中的多糖切下来，得到游离的N-糖链，再结合毛细管电泳、高效液相色谱和质谱等技术对其进行分析。但由于游离N-糖链为多羟基醛类化合物，本身没有发色基团，紫外检测器几乎无法检测，且质谱响应也较差，常规电喷雾离子源正负离子模式下灵敏度都不高，这也造成常规高效的检测方法如毛细管电泳(CE)、高效液相色谱(HPLC)及液质联用(LC-MS)等对其分析困难。针对这种情况，现有技术多是通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团，增加其检测的灵敏度，例如通过2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide，2-AB)或者是2-氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid，2-AA)法进行标记使分析物带上荧光，经脱盐柱纯化后去掉多余的标记试剂，之后再使用分离分析技术如CE和HPLC手段，对荧光标记的寡糖链进行分析。

但是该方法目前存在很多问题，例如：

⑴单个样品前处理时间太长，从拿到样品到拿到结果需要至少3个工作日；

⑵常规分析方法在标记过程中使用的还原剂氰基硼氢化钠均为有毒试剂，对实验室的环境和实验人员的健康产生威胁；

⑶常规2-AA或者是2-AB法标记试剂需要通过脱盐去掉多余的标记试剂，增加物料成本；

⑷常规方法的荧光信号不稳定，低荧光信号会影响检测的准确度，特别是占比比较小的峰。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种糖蛋白N-糖链分析方法，包括：

a)将待分析糖蛋白用2-甲基嘧啶硼烷及二硫键还原剂进行蛋白展开变性及二硫键还原处理；

b)将步骤a)处理后的蛋白烷基化处理，N-糖苷酶F酶切；

c)将酶切好的样品干燥后使用标记物标记并根据所述标记物对N-糖链进行分析；所述标记物为普鲁卡因酰胺和/或其盐。

可选的，如上所述的糖蛋白N-糖链分析方法，所述2-甲基嘧啶硼烷以RapiGest SF溶液的形式加入，RapiGest SF终浓度为0.5mg/ml～1.5mg/ml。

可选的，如上所述的糖蛋白N-糖链分析方法，所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇。

可选的，如上所述的糖蛋白N-糖链分析方法，步骤a)中，待分析糖蛋白与2-甲基嘧啶硼烷及二硫键还原剂于34℃～40℃共孵育20min～40min。