[发明专利]一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。萤火虫萤光素酶具有较长的氨基酸序列，在对其进行分析及突变改造的前期工作中，本发明人考虑了大量的位点，针对各个位点进行独立地或组合地分析及实验，确定了K357E、P394A和D34V三个突变位点。本发明的萤火虫萤光素酶突变体具有活性高、稳定性高的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。

背景技术

萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase)是一种在三磷酸腺苷(ATP)、二价金属离子如镁离子和氧气的存在下催化氧化萤火虫萤光素并使其产生生物发光的酶。在过量的萤火虫萤光素酶和萤光素存在的情况下，萤光的产生和反应中存在的ATP的量成正比，这种发光特性使得萤火虫萤光素酶在各种测定ATP的研究、生产等过程中广泛应用。

为了提高萤火虫萤光素酶在ATP检测中的实用性，已有的研究在野生型萤火虫萤光素酶上制作了各种突变体，以提高萤火虫萤光素酶的性能(CN 105200022A、CN105368852 B、CN100516223C)和发光强度(CN 102191213A)等，也利用基因工程等技术在萤火虫萤光素酶的制备方法上做了大量的研究(CN 101993858A)，萤火虫萤光素酶的稳定性、活性和产量等都有了一定程度的改进。

然而，随着技术的进步，本领域中对于细胞活力检测等提出了更高的要求。为了更好地应用这项技术，亟待对萤火虫萤光素酶的活性、稳定性等进行进一步地提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种萤火虫萤光素酶突变体，其是：(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶，选自下组的位点或位点组合发生突变的酶：第357位，第394位或第34位；(b)将(a)酶的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如8个，5个，3个，2个，1个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)酶的功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；(c)与(a)酶的氨基酸序列有85％以上同源性(较佳地88％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)且具有(a)酶功能/活性的由(a)衍生的酶，但对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶的第357位，第394位或第34位的氨基酸与(a)酶相应位置突变后的氨基酸相同；或(d)在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个优选例中，所述“具有(a)酶的功能/活性”包括，与(a)酶的活性相比，具有其至少85％以上、90％以上、95％以上的活性。

在另一优选例中，第357位由Lys突变为Glu(K357E)；第394位由Pro突变为Ala(P394A)；第34位由Asp突变为Val(D34V)；较佳地，所述的萤火虫萤光素酶突变体包括：SEQID NO:3，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:2。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸编码所述的萤火虫萤光素酶突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括霉菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞等。