[发明专利]一种诱导型启动子的进化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导型启动子的进化方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过易错PCR对麦芽糖诱导型启动子进行突变获得启动子突变体库，再通过偶联细胞生长的方式高通量筛选突变体，获得不同响应灵敏度和强度的启动子突变体；所述麦芽糖诱导型启动子后连有编码融合蛋白的基因，所述融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和定量报告基因表达量的作用。本发明进化得到的诱导型启动子对诱导剂麦芽糖的响应阈值范围从0‑3g/L扩展至0‑25g/L，最高诱导表达强度较原始启动子提高约3.5倍。

技术领域

本发明涉及一种诱导型启动子的进化方法及其应用，尤其是一种麦芽糖诱导型启动子的进化方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

启动子是RNA聚合酶的识别序列，可以起始DNA的转录，对于外源蛋白的表达具有重要作用。由于诱导型的启动子具有操作简单、可调控等优点，近年来，人们对诱导型启动子的诱导表达进行了广泛的研究，开发了不同的诱导型表达系统，实现异源蛋白的高效表达或基因表达的精确调控，已经广泛应用于酶工程、蛋白质工程以及代谢工程等领域。例如，在大肠杆菌中，T7表达系统在非诱导条件下能使目标基因处于沉默状态，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白即可占细胞总蛋白的50％以上；枯草芽孢杆菌中常用的诱导型启动子包括受IPTG诱导的P_spac启动子，受木糖的诱导的P_xyl启动子及受蔗糖诱导的P_sacB启动子。虽然诱导型启动子存在上述优势，但在应用中也有自己的缺陷，例如诱导表达强度过低，诱导剂响应阈值不合适(灵敏度偏高或偏低)等问题，需要进一步研究和完善，获得更多表达效果好及诱导调控灵敏的启动子，以满足不同的表达条件。

根据突变体库的构建方法，进化可以分为体外进化和体内进化。体外进化运用最多的突变方法是易错PCR和DNA重排技术，模拟自然状态下的基因突变和同源重组，可以有效控制突变率等参数。基于易错PCR方法在体外快速构建突变库，经分子克隆、转化、高通量筛选等循环操作，产生符合要求的启动子突变体库。近些年来发展起来的细胞分选系统，如流式细胞仪和微流控，为超高通量筛选提供了高效方法。

发明内容

[技术问题]

本发明所要解决的技术问题是现有的诱导型启动子在应用过程中存在诱导表达强度过低、诱导剂响应阈值不合适(灵敏度偏高或偏低)的问题。

[技术方案]

本发明提供一种诱导型启动子进化的方法，该方法通过易错PCR对目标麦芽糖诱导型启动子P_glvc(P_glvc是含碳代谢元件cre序列发生突变的麦芽糖诱导启动子，有利于提高麦芽糖对该启动子的诱导，降低葡萄糖对该启动子的抑制)进行突变获得启动子突变体库，再通过偶联细胞生长的进化方法进行高通量筛选，获得不同响应灵敏度和强度的启动子突变体。

所述诱导型启动子进化的方法，是在麦芽糖诱导型启动子P_glvc后面设计一个双筛选标记的融合蛋白，融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和基因表达的定量报告的作用，从而反映麦芽糖诱导型启动子P_glvc及其突变体在不同条件下的转录强度；其中，tetA蛋白有将四环素转运出细胞保持耐四环素抗性和转运Ni²⁺进入细胞的功能，荧光蛋白作为报告蛋白用于对基因表达量进行定量。

所述诱导型启动子进化的方法，步骤包括：突变体库的构建、突变体库的筛选以及发酵验证，具体地：

(1)将绿色荧光蛋白基因EGFP连接到pHT01质粒上，获得质粒pHT01-EGFP；再将质粒pHT01-EGFP上的P_grac启动子替换成启动子P_glv，得到质粒PHT01M1；

(2)对质粒pHT01M1进行线性PCR，以将P_glv启动子上的碳代谢元件cre序列上的GC突变为AT，得到携带突变启动子P_glvc的质粒pHT01M11；