[发明专利]一种基于序列设计的无细胞体系线形模板降解抑制方法

说明书

本发明属于合成生物学蛋白表达模板设计领域，具体提供了一种基于序列设计的用于大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制的方法：向线形基因模板的端部添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列来抑制线形基因模板在无细胞基因表达体系内的降解；本发明的方法能够有效提高基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的蛋白表达量，推动基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的发展，扩大无细胞基因表达体系的应用范围。

技术领域

本发明属于合成生物学蛋白表达模板设计领域，具体涉及一种用于无细胞蛋白质表达模板设计的方法。

背景技术

无细胞基因表达在生命科学中用作基础研究工具已有五十多年的历史。但数十年来一些关键因素限制了其在工程应用上的潜力：蛋白质产量低且不稳定，反应时间不足，试剂成本较高，反应规模小，无法正确折叠复杂蛋白质和蛋白质组件，转录限于内源性细胞RNA聚合酶。近年来，技术的发展已经开始系统地解决这些局限性，从而使得无细胞基因表达能够在新兴的合成生物学领域中得到广泛的应用。近年来，以线形DNA为模板的无细胞基因表达逐渐受到人们的关注。无细胞基因表达体系通常采用环形质粒DNA作为模板。与环形质粒DNA相比，线形DNA的构建更为简单。环形质粒DNA的克隆通常是将目标质粒化转入感受态细胞内，而后通过细胞克隆，从细胞中提取出大量的目标质粒。而线形DNA的获取只需通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）扩增得到复数的线形DNA，简化了克隆步骤，进一步缩短了实验周期，提高了实验效率。以线形DNA为模板的无细胞基因表达也因此得到了更为广泛的应用。

目前，以线形DNA为模板的无细胞基因表达仍存在一些问题，阻碍了其进一步的发展。其中主要的一个问题就是以线形DNA为模板的无细胞基因表达蛋白质的表达量远低于以环形质粒DNA为模板的无细胞基因表达。造成这种差异的主要原因是线形DNA易被无细胞基因表达体系中细胞提取物中的DNA酶降解。在相关的DNA酶中，RecBCD酶被认为是主要降解线形DNA的核酸外切酶。基于这一点，目前的研究主要集中在抑制RecBCD酶的活性上。为抑制RecBCD酶的活性，前人的尝试包括利用GamS蛋白抑制RecBCD酶的活性；筛选合适的小分子抑制剂抑制RecBCD酶的活性；将线形DNA与材料结合抑制线形DNA降解。但目前的研究仅局限于添加外源的抑制剂或者保护剂来提高线形DNA在无细胞基因表达体系内的稳定性，并且目前的稳定效果均有限。此外，这种添加外源的抑制剂或者保护剂的方式操作复杂，成本较高，缺乏足够的灵活性，且会对无细胞基因表达体系本身产生一定的扰动。

尽管已经有研究基于无细胞基因表达体系内线形DNA的降解问题给出了一定的解决方法。但目前的抑制效果仍十分有限，且缺乏足够的灵活性，不能满足无细胞基因表达体系对蛋白质合成的要求。因此需要开发一种更加简便且有效的无细胞基因表达体系线形DNA模板的降解抑制方法。而序列设计在线形DNA降解抑制中的重要作用仍未被挖掘。通过序列设计的方式提高线形DNA在无细胞基因表达体系内的稳定性为线形表达模板的降解问题提供了一种简便可行的解决方案，不仅成本低廉，设计灵活，并且拥有广阔的研究前景。

发明内容

为了解决上述问题：

一方面：本申请提供了一种基于序列设计的用于大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制的方法，其特征在于：向其中线形基因模板的端部添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列来抑制线形基因模板在无细胞基因表达体系内的降解。

进一步地，向线形基因模板的两端添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列

进一步地，所述无细胞基因表达体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。

进一步地，所述线形基因模板为线形DNA，其获得方式为以质粒模板进行PCR。

进一步地，所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列GC含量为60-65%，优选为选自SEQ ID NO.1-6的序列。