[发明专利]一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法

说明书

本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法。首先先制备带有内标分子4‑MBA的金包银核壳结构纳米颗粒以及带有金纳米颗粒的硅片作为二维基底，通过microRNA循坏放大系统，制备出能特异性识别microRNA的捕获探针，利用捕获探针将金包银核壳纳米颗粒与二维基底耦合起来，使标记分子拉曼信号获得巨大增强，最终得到高灵敏SERS光谱检测结果，并根据SERS探针的拉曼信号强度与二维基底硅片上的二阶峰信号强度的比值，推算出溶液中microRNA的浓度。本发明提供的的这种microRNA表面增强拉曼光谱检测方法可作为一种简单、快速、高效的检测血清中microRNA的超灵敏定量检测方法加以推广应用。

技术领域

本发明属于生物医学microRNA检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法。

背景技术

目前检测microRNA的传统方法有印迹法、微阵列技术、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)等。由于microRNA在总RNA样本中的丰度较低，且易于降解，这些传统方法在敏感性和特异性方面存在固有的局限性。因此，迫切需要能够克服上述缺点的快速、超灵敏、特异的检测方法。

激光拉曼光谱可以在分子水平上探测物质结构，它具有直接、准确、快速、无损等优点。目前，拉曼光谱技术已被广泛地应用于生物医学、高分子化学、生物化学、环境科学等许多领域的研究。但是，由于常规拉曼散射固有的散射截面非常小(每个分子只有10cm^-1-30cm^-1)导致拉曼散射效率极低，并且常规拉曼光谱信号极易受到强烈的荧光背景信号的干扰，这些缺点大大限制了拉曼光谱技术在生物医学领域的实际临床应用。而表面增强拉曼散射不但能够很好的猝灭生物样品的荧光，能够用相对较弱的激光功率去激发生物分子，获得理想的SERS光谱信号，对生物分子没有损伤，而且具有极高的检测灵敏度，甚至可以实现单分子检测。因此，利用SERS技术对血液中的生化分子进行超灵敏定量检测研究，很可能成为一种方便、无损、极具潜力的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用SERS技术能够特异性检测血清中microRNA的方法。该方法以4-MBA作为拉曼信号标记分子，合成Ag@4-MBA@Au纳米颗粒，通过冰冻法将Probe DNA接到核壳纳米颗粒表面。再制备表面带金纳米颗粒的硅片，通过直接与SHDNA链孵育，形成带DNA链的二维基底，通过循环放大系统制备能特异性识别microRNA的CaptureDNA，利用Capture DNA将核壳纳米颗粒与二维基底耦合起来。根据拉曼标记分子4-MBA的SERS强度变化以及硅片二阶峰的校准功能，可以实现microRNA的高灵敏度定量检测，为早期癌症筛查、治疗监测和预后评估提供一种可靠的临床辅助方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法，包括如下步骤：

1)制备表面增强拉曼光谱(SERS)基底

1-1)合成银纳米胶体AgNPs：取0.017g的AgNO₃颗粒，加入100mL超纯水，剧烈搅拌至沸腾后，加入3mL质量分数为1％的柠檬酸钠，在沸腾状态下继续剧烈搅拌60-70分钟，溶液颜色由透明逐渐变为灰绿色，室温冷却；

1-2)合成金纳米胶体AuNPs：在99mL超纯水中加入1％的氯金酸溶液，剧烈搅拌至沸腾状态后加入1mL质量分数为1％的柠檬酸钠，继续加热搅拌20-30分钟，溶液颜色逐渐变为深酒红色，室温冷却；

1-3)合成Ag@4-MBA溶液：在银纳米胶体AgNP中加入4-MBA信号分子1mM，搅拌10-12h，得到Ag@4-MBA溶液，将该溶液离心洗涤后重悬于超纯水中；