[发明专利]一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法

权利要求书

1.一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备表面增强拉曼光谱基底

1-1）合成银纳米胶体AgNPs:将AgNO₃溶液在剧烈搅拌下加热至沸腾状态，加入还原剂柠檬酸钠溶液，使AgNO₃溶液保持沸腾状态，继续搅拌60-70分钟后，室温冷却；

1-2）合成金纳米胶体AuNPs：在水中加入氯金酸溶液，加热搅拌至沸腾状态，加入还原剂柠檬酸钠，继续加热搅拌20-30分钟，室温冷却；

1-3）合成Ag@4-MBA溶液:在银纳米胶体AgNPs中加入4-MBA信号分子，搅拌10h-12h，得到Ag@4-MBA溶液，将该溶液离心洗涤后重悬于水中；

1-4）合成带有SERS信号分子的金包银核壳结构纳米颗粒Ag@4-MBA@Au NPs：在聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氢氧化钠、抗坏血酸和制备好的Ag@4-MBA溶液，搅拌反应10-20分钟后，逐滴加入氯金酸溶液，反应30-50分钟，形成金包银核壳纳米颗粒Ag@4-MBA@Au NPs，将溶液离心洗涤后重悬于水中；

1-5）合成带有聚乙烯吡咯烷酮包裹的金纳米胶体：将金纳米胶体AuNPs离心后重悬于聚乙烯吡咯烷酮溶液中，再次离心重悬在无水乙醇溶液中，放入冰箱4°C保存；

1-6）合成表面带有金纳米颗粒的硅片：将硅片置于乙醇中超声8-10分钟，取出干燥后备用；将带有聚乙烯吡咯烷酮包裹的金纳米胶体与二氯甲烷和水充分混合，随后加入正己烷，静置分层后，用硅片浸入液体中，利用提拉法将金膜附在硅片上并取出硅片，形成表面带有金纳米颗粒的硅片；

2）修饰DNA单链

2-1）制备Probe DNA-Ag@4-MBA@Au NPs：将单链Probe DNA溶液与Ag@4-MBA@Au NPs溶液混合，放入-20°C冰箱，冰冻2-3小时，随后室温解冻后，形成ProbeDNA-Ag@4-MBA@Au NPs溶液，将该溶液离心洗涤后重悬在水中；

2-2）制备SH DNA-Si芯片：将SH DNA溶液与表面带有金纳米颗粒的硅片在室温下孵育10-12小时，用水清洗硅片后，用6-巯基-1-己醇浸泡硅片30-40分钟，随后用水冲洗硅片，室温晾干；

3）构建microRNA循环放大系统

将发夹DNA链H1、发夹DNA链H2和不同浓度的microRNA链充分混合，在室温下反应2小时，得到产物捕获DNA双链溶液；

4）SERS检测传感器的组装

将ProbeDNA-Ag@4-MBA@Au NPs溶液和捕获DNA双链溶液混合，滴在SH DNA-Si 芯片上，在室温下共同孵育3-4小时，随后用PBS缓冲液冲洗硅片并室温晾干，为接下来的SERS检测做准备；

5）MicroRNA的检测

用拉曼光谱仪检测不同浓度microRNA的金包银核壳纳米颗粒Ag@4-MBA@Au NPs中的4-MBA SERS信号与硅片上二阶峰的信号，其中，拉曼测试条件为：λ=785 nm，扫描波数范围为600-1800 cm^-1。

2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法，其特征在于：步骤1-6）中，将硅片裁剪成5mmx5mm的正方形，再置于乙醇中超声。

3.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱技术的microRNA超灵敏检测方法，其特征在于：步骤2）、步骤3）涉及的碱基序列如下：

Probe DNA：5’-ATTCGGTCAACAGATTTTTTTTTT-3’；

SH DNA：5’-TGGTGCACGATGAGTTTTTTTTTT-3’；

H1：5’-TCTGTTGACCGAATATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGCCGTGTAGTCTTATCAGACT-3’；

H2：5’-CTCATCGTGCACCAGGTGATAAGACTACACGGCTTAGCTTATCAGACTAGCCGTGTAG -3’。