[发明专利]表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途。本发明的融合蛋白包括Ag85B‑ESAT‑6(简称AE)和Rv2031c‑Rv2626c(简称R2)，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑4所示，本发明还提供了表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒，该重组腺病毒诱发的针对结核分枝杆菌的特异性免疫更全面，不仅能够识别增殖期的结核分枝杆菌，也能识别休眠期的结核分枝杆菌，产生的抗结核分枝杆菌的免疫保护效果将更强。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为全球重要的传染病，是危害人类健康的第一杀手。卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗，但其只对儿童结核病有保护效果，而对成人结核病没有保护效果，研制新型结核病疫苗是全球重要的亟待解决的公共卫生问题。以腺病毒作为载体表达结核分枝杆菌抗原，目前已被广泛用于结核病新型疫苗的研究。然而，当前研究的以腺病毒为载体的新型疫苗中，表达的结核分枝杆菌抗原较为单一，针对结核分枝杆菌的免疫保护力不够强，尤其是针对机体内结核分枝杆菌的休眠菌，缺乏特异性识别，不能产生免疫保护效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白的重组腺病毒及其用途。

本发明的目的之一是提供结核分枝杆菌多阶段抗原融合基因，所述融合基因为Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明的目的之二是提供结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白，所述融合蛋白包括Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c，由所述融合基因编码，所述Ag85B-ESAT-6和Rv2031c-Rv2626c的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

本发明的目的之三是提供一种重组载体，所述的重组载体为包括所述融合基因以及EF1启动子的pAdTrack-CMV载体，命名为pAdTrack-AE-EF1-R2载体，所述EF1启动子序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：

将Ag85B-ESAT-6融合基因插入pAdTrack-CMV载体KpnI和PvuI位点之间，将EF1启动子插入同一个pAdTrack-CMV载体的PvuI和AluI位点之间，将Rv2031c-Rv2626c融合基因插入同一个pAdTrack-CMV载体AluI和XhoI位点之间，后将pAdTrack-CMV载体转化至DH5α感受态细胞，经抗性筛选、平板挑菌和阳性克隆鉴定，得到重组载体。

本发明的目的之四是提供一种表达所述融合基因的重组腺病毒。

进一步的，所述重组腺病毒的制备方法包括如下步骤：

将所述重组载体和骨架质粒pAdeasy-1共转染宿主细胞，培养并收获、纯化从所述细胞中释放的重组腺病毒。

进一步的，所述宿主细胞为HEK293细胞。

更进一步的，将所述重组腺病毒进行扩大培养，并对培养产物进行纯化。

本发明的目的之五是提供所述重组腺病毒在制备用于预防结核分枝杆菌感染和预防结核病的疫苗中的用途。进一步的，所述重组腺病毒被制备为滴鼻剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：