[发明专利]一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用

说明书

本发明涉及快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用，可有效解决快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，实现定向选择所需性质优化酶的问题，方法是，将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；进行聚合酶链式反应，得PCR产物，PCR产物加入饱和醋酸钠和乙醇，离心，沉淀室温晾干，再加入无菌去离子水溶解，按照酵母转化法将PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆，提取酵母基因组DNA，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率、基因突变率，实现快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，本发明方法易操作，省时省力，工作效率高，应用面广，经济和社会效益巨大。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，特别是一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用。

背景技术

蛋白质类的产品在生活生产中有着广泛的应用，以各种酶制剂的应用最为突出，包括洗涤试剂、饲用酶制剂、食品添加剂、科研工具酶、造纸用酶、环保用酶、医疗用酶等等，为了获得性质更加优越、更符合实际应用需求的酶，需要对天然来源的酶进行人工突变来改变酶的热稳定性、pH耐受性、蛋白酶耐受性、单位活力值等特性。突变的方法包括定点设计突变和体外定向进化，易错PCR为一种常用的随机突变技术，属于酶体外定向进化范畴，利用Taq DNA聚合酶不具有3’→5’校对功能的特性，配合适当条件，以很低的几率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，凭借定向选择的方法选出所需性质的优化酶(蛋白质)。但现有易错PCR随机突变方法构建突变体文库操作复杂，工作效率低，不易定向选择所需性质的优化酶，满足不了蛋白质产品生产的实际需要。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用，可有效解决快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，实现定向选择所需性质优化酶的问题。

本发明解决的技术方案是，一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，省去传统DNA易错PCR后质粒的构建与后续质粒处理工作，快速实现含有目的基因突变体的毕赤酵母工程菌株文库的构建，包括以下步骤：

(1)、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中(载体购自Invitrogen公司)，构建质粒；

(2)、进行聚合酶链式反应：

采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'

GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'

进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.2-0.3mM的4种dNTP(脱氧腺苷三磷酸)，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0-0.6mM的任意一种dNTP以及0-0.5mM的氯化锰(MnCl₂)，以步骤(1)构建的质粒为模板进行聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物；

(3)、用PCR产物回收试剂盒回收步骤(2)的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH5.3)和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物；

(4)、按照酵母转化法(如Invitrogen公司的酵母转化法)，将步骤(3)回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆；