[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA‑125a的小鼠模型及构建方法，本发明利用CRISPR/Cas9技术，在C57BL/6J小鼠中实现pre‑miRNA‑125a的基因组片段敲除。在小鼠基因组中设计一对用于片段敲除的sgRNA，在体外将两条sgRNA转录，与Cas9核酸酶共注射C57BL/6J小鼠受精卵，移入母体内发育成为原代(F0)小鼠；F0小鼠经鉴定与纯化后获得片段敲除的纯合个体。在纯合敲除小鼠中miRNA‑125a表达量显著降低。本发明提供了一种精确、高效、简便敲除miRNA‑125a的办法，可用于miRNA‑125a功能研究的小鼠模型，对实现其它miRNAs的片段敲除亦有参考价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法。

背景技术

基因的定点修饰技术是研究基因功能的重要手段之一，继早期的基因打靶后，目前研究者共发现了三代人工核酸内切酶。第三代人工核酸内切酶Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)因其操作简便、成本低廉、作用高效而得到了广泛应用[1]。其中，又以CRISPR/Cas9为迄今应用最广泛的基因编辑工具，它由crRNA和tracrRNA嵌合在一起的一条RNA链——sgRNA(singleguide RNA)和Cas9蛋白两部分组成。Cas9蛋白是一种核酸内切酶，包括RuvC和HNH两个活性中心，在sgRNA的指导下可以分别切割DNA的一条链，最终造成DNA双链断裂(DSB)[2]。在细胞对损伤的DNA进行修复过程中，会造成碱基的突变、插入或缺失，进而有造成该基因失活的可能。该技术诞生后不久，研究者很快就在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑[3,4]，随后又在多种生物体内得到了应用，成功获得了多种基因修饰后的生物[5]。

miRNA是一类长约22nt，具有广泛生物活性的ncRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’UTR上的靶点进行碱基互补配对实现对靶基因的表达调控，当它与靶点完全互补时，RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)会使mRNA发生降解；而当miRNA与靶点序列不完全互补时，RISC则能对mRNA的翻译起到抑制作用[6,7]。哺乳动物中，大多数编码蛋白质的mRNA都会受到miRNA的调控。已有研究显示miRNAs与早期妊娠密切相关。

miRNA-125a是一种在进化上高度保守的miRNA，在多种组织中都有表达，在细胞分化、个体发育等过程中发挥着重要调控作用[8]。研究已证实，miRNA-125a与生殖密切相关，有研究者发现，miRNA-125a在大鼠胚胎植入中存在差异表达[9]；此外，在pri-miRNA-125a编码基因中有两个SNPs，此外，在两个SNPs下游有一突变位点，该突变与这两个SNP共存能够增加复发性流产(RSA)的发生风险[10]。

包括miRNA在内的ncRNA直接在RNA水平上行使功能，因此生物体在对DSB进行修复时，少数几个碱基的改变可能无法完全使ncRNA失活。之前已有报道证实可以利用CRISPR/Cas9系统实现多基因的敲除[11]。采用该办法，有研究者在斑马鱼中注射Cas9蛋白mRNA和位于pre-miRNA-126a两侧的两条sgRNA，虽然效率还不甚理想，但是实现了对miRNA的片段敲除[12]。

为解决分别导入两条sgRNA效率不高的问题，我们对pX458载体进行了改造。pX458是一种sgRNA骨架和Cas9蛋白二合一的质粒，筛选标记为EGFP。我们体外合成一段双链DNA，包括U6启动子、酶切位点以及sgRNA骨架，将其插入到原载体中，即可获得同时表达两条sgRNA的改造载体，进而使实现高效基因组片段敲除成为可能。

近交系是指一个动物群中，任何个体基因组中99％以上的等位位点为纯合；C57BL/6J小鼠是一种常见的近交系，以57号母鼠和52号公鼠交配为起源，因其遗传背景清晰，被广泛应用于遗传学研究中。