[发明专利]基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法

权利要求书

1.分泌性荧光素酶表达盒，其特征是：

所述荧光素酶表达盒为hr5增强子-IE1启动子-L21-secrNluc-IE1终止子，其核酸序列如SEQ ID NO：1所述。

2.基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法，其特征是包括以下步骤：

1.1、制备sf9昆虫细胞悬液；

1.2、制备重组杆状病毒标准样品：

利用如权利要求1所述的分泌性荧光素酶表达盒，构建获得分泌性荧光素酶共表达克隆载体pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc，

再利用pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc制备获得重组杆状病毒vAc-secrNluc，从而获得相应滴度的病毒标准样品；

1.3、制备待测重组杆状病毒样品：

利用pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc，构建EGFP基因的克隆载体pFastBacDual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP；

再利用pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP制备获得待测病毒样品vAc-secrNluc-EGFP；

1.4、病毒接种和酶活测定：

病毒标准样品接种于sf9的细胞悬液中，感染特定时间后进行酶活测定，得到该特定时间点的病毒标准样品的实际荧光素酶活性；

1.5、以病毒标准样品病毒滴度的对数值作为横坐标，以其实际荧光素酶活性的对数值作为纵坐标，制作标准曲线和直线回归方程：

logE＝a×logN+b；

N：病毒滴度，pfu/mL；

E：荧光素酶活性值，RLU；

a,b：分别为直线回归方程的斜率和截距；

1.6、以待测病毒样品替代病毒标准样品，进行步骤1.4，从而获得待测病毒样品的荧光素酶活性；代入步骤1.5所得的直线回归方程中，从而获得待测病毒样品的病毒滴度。

3.根据权利要求2所述的基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法，其特征是：

步骤1.2为：

参照Bac-to-Bac方法，将所构建质粒pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc转化到DH10Bac感受态细胞，通过蓝白筛选重组克隆，抽提重组Bacmid DNA，转染sf9细胞，从而得到重组杆状病毒vAc-secrNluc，制备成特定滴度的病毒标准品；然后进行梯度稀释，从而获得相应滴度的病毒标准样品；

步骤1.3为：

在pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc基础上，克隆增强型绿色荧光蛋白基因EGFP到多角体基因启动子下游多克隆位点，构建EGFP基因的克隆载体pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP；参照步骤1.2，将克隆载体pFastBac Dual-hr5IE1-L21-secrNluc-EGFP转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白筛选重组克隆，抽提重组Bacmid DNA，转染sf9细胞，从而获得待测病毒样品vAc-secrNluc-EGFP；

步骤1.4为：

病毒标准样品接种于sf9的细胞悬液中，悬浮培养后，离心洗涤置换新鲜培养基，铺种于多孔板中静置培养至感染后特定时间点，取细胞培养上清测定病毒标准样品的荧光素酶活性，并扣除背景荧光素酶活性作为该时间点病毒标准样品的实际荧光素酶活性。

4.根据权利要求2或3所述的基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法，其特征是：

步骤1.1的sf9昆虫细胞悬液中，sf9的细胞密度为1×10⁶-2×10⁶/mL；

步骤1.2中，病毒标准品中重组杆状病毒vAc-secrNluc的滴度为1×10⁹pfu/mL，梯度稀释后的滴度分别为2×10⁸、4×10⁷、8×10⁶、1.6×10⁶、3.2×10⁵pfu/mL，获得6个病毒标准样品；

步骤1.3中，待测病毒样品vAc-secrNluc-EGFP于4℃保存，并分别于保存后90天和180天的时候取样测定滴度；

步骤1.4中，

悬浮培养时间为0.5～1小时；

静置培养至感染后是指以病毒接种时的时间点为起始时间；

背景荧光素酶活性是指离心洗涤后用于多孔板铺种的细胞悬液荧光素酶活性；

病毒标准样品接种的感染复数最大不超过1。