[发明专利]肉毒杆菌毒素的制备方法

说明书

本发明涉及一种肉毒杆菌毒素的制备方法，所述方法能够通过不包括动物来源成分的简化方法以高产率获得肉毒杆菌毒素。根据本发明的肉毒杆菌毒素制备方法在整个过程中不使用任何动物成分，包括培养肉毒梭菌(Clostridium botulinum)菌株，从而提供优异的安全性，与常规的分离方法相比省去使用添加剂处理的单独的核酸去除步骤，并且仅使用离子交换层析进行加工，并且证实通过使用相同的缓冲液并且仅调节缓冲液的浓度和pH的简化方法以显著提高的产率分离肉毒杆菌毒素，因此，本发明是一种非常经济且高效的分离方法，使得由此分离得到的肉毒杆菌毒素预期有效地用于美容和医药领域。

技术领域

本发明涉及一种制备肉毒杆菌毒素的方法，其能够通过简化的方法而不包括动物来源的组分以高产率获得肉毒杆菌毒素。

背景技术

自十九世纪九十年代以来，已经发现了分泌神经毒性毒素的梭菌属的各种菌株，并且已经鉴定了由这些菌株分泌的毒素的特征。来源于梭菌属菌株的神经毒性肉毒杆菌毒素是通过肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在食物中生长而产生的神经毒素，并引起食物中毒，呕吐，视觉损伤，运动障碍等，所述食物未适当灭菌或储存在未适当灭菌的罐内。当这种毒素被摄取时，潜伏期为12至72小时，并且它防止神经递质乙酰胆碱在神经肌肉连接处的释放，引起肌肉麻痹。

肉毒杆菌毒素是一种由氨基酸组成的神经毒性蛋白，根据血清学特征分为总共7种类型，包括A、B、C(C1,C2)、D、E、F和G。每种毒素具有约150kDa的毒性蛋白，并且天然地由其中毒性蛋白与几种非毒性蛋白结合的复合物组成。中等复合物(300kDa)由毒性蛋白和非毒性的非血凝素蛋白组成，而大复合物(450kDa)和大-大复合物(900kDa)呈中等复合物与血凝素结合的形式。已知这些非毒性的非血凝素蛋白具有保护毒素免受肠中低pH和各种类型的蛋白酶的作用。肉毒杆菌毒素首先被合成为大小为150kDa的单一分子，然后截短成约50kDa的轻链蛋白和约100kDa的重链蛋白，并且轻链蛋白和重链蛋白通过二硫键再次连接以最终形成活性肉毒杆菌毒素。

肉毒杆菌毒素抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉连接的突触前细胞处的释放。乙酰胆碱存在于突触前细胞内的突触囊泡中，当动作电位信号到达突触前细胞时，突触囊泡与突触前膜融合，从而将乙酰胆碱释放到突触间隙中。SNARE蛋白对于突触囊泡和突触前膜的融合是必需的，并且主要被分成位于突触囊泡处的囊泡SNARE(v-SNARE)蛋白和位于突触前膜处的靶SNARE(t-SNARE)蛋白。具体而言，小突触泡蛋白作为v-SNARE起作用，并且SNAP-25和突触融合蛋白作为t-SNARE起作用。肉毒杆菌毒素进入突触前细胞的内部，切割SNARE蛋白，因此该蛋白不再起作用。因此，乙酰胆碱在神经肌肉连接的突触前细胞处不释放，并且神经对肌肉的控制变得不可能，导致松弛性麻痹。具体地，肉毒杆菌毒素蛋白的重链允许毒素进入突触前细胞的内部，并且其轻链允许毒素切割SNARE蛋白。已知包括A、B、C(C1,C2)、D、E、F和G在内的七种类型的肉毒杆菌毒素切割不同的SNARE蛋白。

由于肉毒杆菌毒素对人体是少量致死的并且易于大量产生，因此它可以与炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和天花病毒一起用作四种主要的生物武器之一。然而，发现以低于不影响人体剂量的剂量全身注射A型肉毒杆菌毒素可麻痹注射部位的局部肌肉。由于这种特性，它可以广泛地用作去皱剂，痉挛性偏瘫和脑性瘫痪等的治疗剂，并且随着医学适应症的增加，其需求迅速增加。响应这种需求，正在积极进行对肉毒杆菌毒素生产方法的研究。

在这一点上，常规上通过改变和增加工艺步骤和条件进行各种尝试以高产率获得肉毒杆菌毒素。例如，美国登记专利号6818409公开了一种使用阳离子交换层析和乳糖凝胶柱层析纯化肉毒杆菌毒素的方法，而美国登记专利号8927229公开了一种使用阴离子-阳离子-疏水相互作用层析而不使用动物来源的组分获得肉毒杆菌毒素的方法。然而，这些常规方法的问题在于，以高产率获得肉毒杆菌毒素的纯化方法复杂且困难。