[发明专利]金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法在审
申请号: | 202011562037.5 | 申请日: | 2020-12-25 |
公开(公告)号: | CN112646828A | 公开(公告)日: | 2021-04-13 |
发明(设计)人: | 张伟 | 申请(专利权)人: | 武汉艾迪康医学检验所有限公司 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;C07K14/31;C12R1/19 |
代理公司: | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人: | 黎双华 |
地址: | 430023 湖北省武汉市江汉区*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 金黄色 葡萄球菌 蛋白 重组 表达 方法 | ||
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法,包括步骤一:在SPA的cDNA序列两端增加Nde I和EcoRⅠ两个酶切位点和HIS标签,构建金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)表达质粒pET28‑SPA,并用提取的质粒为模板进行PCR,使用正向引物SPA‑His‑F和反向引物SPA‑R对pET28‑SPA重组质粒进行PCR检验;步骤二:在原核生物中的表达重组质粒:将步骤一所述重组质粒引入原核表达系统中表达SPA。
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域,特别涉及金黄色葡萄球菌蛋白A在大肠杆菌中的表达和鉴定。
背景技术
大肠杆菌(肠埃希氏菌,E.coli)是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,他不仅具有遗传背景简单清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本廉价,可以加速大规模生产目睹蛋白等优点,而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达体系、表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。目前国内大多数重组蛋白如 rhINF、rhGM-CSF、rhTNF等均采用E.coli作为宿主细胞进行表达。
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SPA)为金黄色葡萄球菌细胞壁的成分,占整个细胞壁蛋白的6.7%。SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG 中的Fc片段结合,但亲和性各不相同,此外还可以和血清中少量的IgM和IgA 结合,因此已经广泛的应用于Ig亚类的检测盒分离纯化,酶的固定化及各类生物分子的检测等。SPA还能部分取出肿瘤患者和带瘤动物血清中的封闭抗体,从而降低血清对淋巴细胞接到的细胞毒的封闭作用。由于SPA的一些特殊的免疫学特性,引起广大免疫学者的关注,并逐步发展程免疫学上一种极为有用的工具。近年来,有关SPA分泌融合体系的构建已日趋完善,并已广泛用来在细胞中表达纯化异源蛋白的产物。
发明内容
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法,培养操作简单、转化和转导效率高。
一种金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤一、构建金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)表达质粒pET28-SPA:
在SPA的cDNA序列两端增加Nde I和EcoRⅠ两个酶切位点和HIS标签,具体为Nde I-His-cDNA-EcoRⅠ,所述cDNA序列如SEQ ID NO.1所示;合成后的基因片段连接在pUC-57T克隆载体上;用Nde I和EcoRⅠ双酶切获取目的片段,回收克隆到原核表达载体pET-28a上,得到重组质粒;
用提取的质粒为模板进行PCR,使用正向引物SPA-His-F和反向引物SPA-R 对pET28-SPA重组质粒进行PCR检验:
SPA-His-F:GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATATGCACCATCATC
SPA-R:GAATTCTTAGCACTTCGGTGCT;
步骤二、在原核生物中的表达重组质粒:将步骤一所述重组质粒引入原核表达系统中,表达SPA,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1
ATGCACCATCATCACCATCACGTGGACGCTAAATTCGATAAAGAACA GCAGAATGCGTTTTATGAAATTCTGCACCTGCCGAACCTGACCGAAGAGC AGCGTAACGCATTTATCCAAAGTCTGAAAGATGATCCATCTCAGAGCGCG AACCTGCTGGCGGAGGCCAAGAAGCTGAATGACGCCCAAGCACCGAAGT GCTAA。
SEQ ID NO.2
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