[发明专利]金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌蛋白A重组表达方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一、构建金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)表达质粒pET28-SPA：

在SPA的cDNA序列两端增加Nde I和EcoRⅠ两个酶切位点和HIS标签，具体为Nde I-His-cDNA-EcoRⅠ，所述cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；合成后的基因片段连接在pUC-57T克隆载体上；用Nde I和EcoRⅠ双酶切获取目的片段，回收克隆到原核表达载体pET-28a上，得到重组质粒；

用提取的质粒为模板进行PCR，使用正向引物SPA-His-F和反向引物SPA-R对pET28-SPA重组质粒进行PCR检验：

SPA-His-F:GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATATGCACCATCATC SPA-R:GAATTCTTAGCACTTCGGTGCT；

步骤二、在原核生物中的表达重组质粒：将步骤一所述重组质粒引入原核表达系统中，表达SPA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中原核表达体系所用的宿主为E.coli BL21。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中将pET28-SPA转化E.coli BL21，培养条件为：单菌落接种于50ml氨苄青霉素抗性LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜，取过夜培养物10ml接种于1L的氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃220r/min培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃220rpm诱导表达4h，离心获得菌体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤三：重组SPA蛋白的纯化，具体是将步骤二收获的菌体用TE缓冲液清洗和悬浮，超声处理后，4℃12000r/min离心20min，上清经Ni²⁺亲和色谱层析进一步纯化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤四：夹心ELISA法检测SPA，就是是将步骤三纯化得到的SPA，加入到包被有一抗的酶标板中，孵育1h，倒掉溶液、洗板，加入检抗，孵育1h，倒掉溶液、洗板，加入显色底物显色。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述一抗为鸡抗SPA。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检抗为HRP标记的兔抗SPA。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤五：WB检测SPA，具体是将步骤三纯化得到的SPA，用SDS-PAGE凝胶电泳检测，将SDS-PAGE胶上SPA转到PVDF膜上，用一抗进行标记和二抗进行显色。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一抗为兔抗SPA。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。