[发明专利]一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种对棒杆菌中NCgl0761基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高氨基酸的发酵产量。所述点突变是使NCgl0761基因序列第92位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G)，使编码的相应氨基酸序列第31位亮氨酸变为精氨酸。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

通过使用具有L-氨基酸生产能力的细菌等微生物发酵，在工业上进行L-氨基酸的生产。作为此类微生物，例如，可以使用从自然界分离的菌株及其突变体菌株。

对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。

用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸。

发明内容

本发明的目的是开发用于改善细菌的L-氨基酸生产能力的新技术，从而提供一种有效生产L-氨基酸的方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人通过研究发现，具有L-氨基酸生产能力的细菌中的基因NCgl0761，可以通过修饰该基因或改善其表达，能够改善细菌的L-氨基酸生产能力。基于这些发现，完成了本发明。

本发明提供了生成L-氨基酸的细菌，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。本发明还提供了通过使用所述微生物生产L-氨基酸的方法。

本发明的第一个方面提供了生成L-氨基酸的细菌，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。

所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl0761编码的蛋白。

所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-氨基酸生产能力。

在本发明中，术语“具有L-氨基酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-氨基酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-氨基酸的细菌。

术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。

具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L-氨基酸的细菌。

L-氨基酸的实例包括碱性氨基酸，如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族氨基酸，如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和甘氨酸；作为羟基-单氨基羧酸的氨基酸，如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状氨基酸，如L-脯氨酸；芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫氨基酸，如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；酸性氨基酸，如L-谷氨酸和L-天冬氨酸；和侧链具有酰胺基的氨基酸，如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。

L-氨基酸的具体实例包括L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸。