[发明专利]氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法

说明书

本发明涉及一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，属于水产品检测技术领域，本发明方法证实了贝类组织中氨基脲同时以结合态和游离态的形式存在，并提供了两种形态氨基脲含量的检测方法。本发明方法在贝类外套膜、性腺、闭壳肌和内脏组织中氨基脲的检测限均为0.5μg/kg。氨基脲在1.0μg/kg～10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。本发明首次建立了环境污染物氨基脲在贝类中存在形态和含量的测定方法，测定结果更加准确可靠，灵敏度高，结果重现性好，定量准确，并首次明确了环境污染物氨基脲在贝类体内的存在形态。

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，是一种用高效液相色谱-串联质谱法(LC/-MS/MS)检测贝类组织中环境污染物氨基脲存在形态和含量的测定方法。

背景技术

氨基脲(Semicarbazide,SEM)一直被认为是呋喃西林药物的特征性代谢产物,常作为监测食品中非法使用呋喃西林药物的标志物。欧盟、日本及中国先后规定呋喃西林及其代谢物在动物源性食品中不得检出。但近年来研究表明，呋喃西林的代谢降解并非是水产品中氨基脲残留的唯一来源，很多途径均可以引入氨基脲污染。氨基脲的主要来源包括：(1)呋喃西林药物的分解呋喃西林是人工合成的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性细菌和阴性菌、某些真菌以及原虫具有抗菌杀虫作用，在水产养殖业中曾被广泛使用。呋喃西林在动物体内可被迅速分解代谢，最终形成稳定性高、残留时间长、毒性作用更强的代谢产物-氨基脲，这是环境中氨基脲的主要来源之一。(2)化工原料和医药合成中间体氨基脲常用作测定和合成醛酮、氰酸盐的试剂。氨基脲被用于许多制药过程，特别是用于金属氨基脲衍生物的有机合成。(3)偶氮二甲酰胺的分解偶氮二甲酰胺常被作为与食品接触的塑料发泡剂使用，其在高温下分解可产生氨基脲，如在玻璃包装食品(包括婴幼儿食品、水果汁、果酱、蜂蜜等)金属盖垫圈中的氨基脲就来源于偶氮二甲酰胺的热分解。此外，偶氮二甲酰胺作为面粉发泡剂，在高温条件下可分解产生氨基脲。(4)食品经次氯酸盐处理可产生氨基脲在经次氯酸盐溶液处理的北海虾、鸡肉、牛奶、蛋白粉、大豆片、红藻和卡拉胶等样品中均检出氨基脲，表明氨基脲是次氯酸盐与食品中氨基酸作用后的产物。(5)氨基脲天然存在于一些动物和植物体内。上述各种途径产生的氨基脲均可能排入环境，成为环境中的一种新型污染物，污染水生生物赖以生存的环境，最终在其体内蓄积。目前已有文献报道部分海域的海水、海底沉积物已经受到不同程度的污染，同时在海洋生物体内检测到氨基脲残留。然而环境中的氨基脲进入贝类体内之后究竟是以结合态形式存在还是以游离态形式存在，目前尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是建立一种环境污染物氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的检测方法。本发明方法证实了贝类组织中氨基脲同时以结合态和游离态的形式存在，并提供了两种形态氨基脲含量的检测方法：分别测定氨基脲总量和结合态氨基脲，再计算游离态氨基脲含量。氨基脲总量测定方法：用盐酸水解样品，2-硝基苯甲醛衍生化，定量加入磷酸氢二钾溶液，加入乙酸乙酯液液萃取，上清液经浓缩、净化后，经液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。结合态氨基脲的测定方法为样品分别用甲醇/水、甲醇和水分别洗涤游离态氨基脲，再加入盐酸水解，按照上述步骤测定结合态氨基脲含量。氨基脲总量减去结合态氨基脲即为游离态氨基脲含量。

本发明方法在贝类外套膜、性腺、闭壳肌和内脏组织中氨基脲的检测限均为0.5μg/kg。氨基脲在1.0μg/kg～10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，它包括氨基脲总量的测定、结合态氨基脲的测定、标准曲线的绘制、所用的仪器条件和定性与定量，具体步骤如下：

1)氨基脲总量的测定

(1)样品水解和衍生化