[发明专利]氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法

权利要求书

1.一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，其特征在于所述方法包括氨基脲总量的测定、结合态氨基脲、标准曲线的绘制、所用的仪器条件和定性与定量；具体步骤如下：

1)氨基脲总量的测定

(1)样品水解和衍生化

样品中加入盐酸、衍生化试剂、SEM-¹³C,¹⁵N₂同位素内标，37℃水解和衍生化16h，取出放置至室温；

(2)提取和净化

向步骤(1)处理后的样品中加入磷酸氢二钾溶液，使样品溶液的pH在7.0～7.5，加入乙酸乙酯液液萃取，涡旋混匀后离心，取上清液转入在45℃下氮气吹干，加入体积比5％甲醇水溶液涡旋振荡溶解残留物，转移至超滤离心管中，14000r/min离心后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；

2)结合态氨基脲的测定

(1)样品分别用甲醇/水、甲醇和水洗涤游离态氨基脲；

(2)然后按照上述步骤1)进行测定；

3)标准曲线的绘制

分别移取一定浓度的氨基脲标准溶液，除不加样品外，按照上述步骤1)中(1)和(2)的操作步骤进行样品水解和衍生化、提取和净化，然后进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；

4)所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6～5μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.3mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1；

表1 流动相梯度洗脱条件

质谱条件如下：

电喷雾离子源；喷雾电压：5500V，正离子扫描；离子源温度：550℃，碰撞气：Medium；气帘气：30psi；雾化气：35psi；辅助加热气：35psi；离子模式：多反应选择监测，选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；

表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

注：*代表定量碎片离子

5)定性与定量

(1)定性测定

在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中定性离子相对丰度一致，其偏差应符合表3要求；

表3 基峰与次强碎片离子丰度比要求

(2)定量测定

取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按内标法定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；氨基脲以其同位素为内标进行定量；

(3)空白实验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；

(4)结果计算和表述

按式(a)计算试样中目标化合物的残留量：

式中：

X—试样中目标化合物的残留量，μg/kg；

C—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/mL；

V—最终样液定容体积，mL；

f—稀释倍数；

m—试样量，g；

注：计算结果需扣除空白值；

氨基脲总量、结合态氨基脲含量按照公式(a)计算得到，游离态氨基脲含量＝氨基脲总量-结合态氨基脲含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中的衍生化试剂为2-硝基苯甲醛的浓度为100mmol/L 2-硝基苯甲醛，加入的体积与样品质量比为入3:40(mL:g)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中盐酸的浓度为0.5mol/L，加入的盐酸体积与样品的质量比为5:2(mL:g)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中加入的磷酸氢二钾溶液浓度为1.0mol/L，加入的体积与样品的质量比为3:1(mL:g)。