[发明专利]一种脐带来源的间充质干细胞培养方法

说明书

本申请提供一种脐带来源的间充质干细胞培养方法，所述方法包括复苏冻存的干细胞，添加培养基培养干细胞；将含有需要传代的细胞的培养液离心，所得的细胞悬液中添加培养液传代；离心含有需要回输的细胞的培养液，离心完成的沉淀添加盐水混匀，倒入回输血袋封口贴标签送至回输中心；离心含有需要冻存的细胞的培养液，离心完成的沉淀添加冻存液混匀，所得的细胞悬液加入冻存管，放置在程序降温盒内降温12h转入液氮。本申请在体外高效分离、培养出了具有高度同源性的间充质干细胞，流式细胞术检测结果显示本申请提供的干细胞具有间充质干细胞特有的免疫学表型，即CD73、CD105、CD90阳性，不表达CD34、CD45、HLA‑DR，且表达率高达95％以上，纯度优秀。

技术领域

本申请涉及生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种脐带来源的间充质干细胞培养方法。

背景技术

干细胞自发现以来一直是科学家们研究的焦点，其具有终身自我更新的能力，并能够分化为特异的细胞类型，从而形成组织、器官。由于干细胞的自我复制、高度增殖及多向分化特点，其成为再生医学研究领域研究的热点，极具潜质及应用前景。成体干细胞是存在于出生后组织中的具备多向分化潜能的一类细胞，大量研究结果显示从心脏、皮肤、卵巢、前列腺等多种组织的上皮中均可分离出相应的干细胞。人脐带血来源的间充质干细胞是具有多向分化特点的成体干细胞，能够用来修复多种组织损伤。与其他类型的间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞体外容易获取且获取量大，获得的细胞较为原始，不会造成机体损伤，患者容易接受，同时不会引起免疫排斥反应及涉及伦理学的问题，故而作为组织工程中的潜在成体干细胞库成员，人脐带血来源的间充质干细胞成为了当前干细胞组织工程领域的又一研究热点。

随着研究的深入,人们发现间充质干细胞具有自我更新和多向分化能力,同时产生的微环境对造血干细胞的归巢和细胞增殖分化均具有重要意义。但现有的间充质干细胞培养方法的效率不甚理想，培养出的间充质干细胞的表达率不高；培养的流程不规范，在培养过程结束后检测培养出的细胞的免疫学表型时，可能得不到所需要的免疫学表型，即培养出的可能不是间充质干细胞，浪费研究人员的时间和精力，浪费实验材料。

发明内容

本申请提供了一种脐带来源的间充质干细胞培养方法，以解决现有的间充质干细胞培养方法的效率不甚理想，培养出的间充质干细胞的表达率不高；培养的流程不规范，在培养过程结束后检测培养出的细胞的免疫学表型时，可能得不到所需要的免疫学表型，即培养出的可能不是间充质干细胞，浪费研究人员的时间和精力，浪费实验材料的问题。

本申请提供一种脐带来源的间充质干细胞培养方法，包括干细胞的复苏、干细胞的传代、干细胞的回输或冻存，其中：

干细胞的复苏：在水浴锅中复苏冻存的干细胞，通过离心操作分离干细胞与冻存液，添加培养基培养干细胞；

干细胞的传代：将含有需要传代的细胞的培养液倒入收集瓶，添加盐水和胰酶消化液清洗培养瓶，添加培养液终止消化，培养液和消化液倒入离心瓶离心，在离心完成的细胞沉淀中添加培养液混悬，所得的细胞悬液中添加培养液传代；

干细胞的回输：将含有需要回输的细胞的培养液倒入收集瓶，添加盐水和胰酶消化液清洗培养瓶，添加培养液终止消化，培养液和消化液倒入离心瓶离心，取离心完成的沉淀添加盐水混匀，倒入回输血袋封口贴标签送至回输中心；

干细胞的冻存：将含有需要冻存的细胞的培养液倒入收集瓶，添加盐水和胰酶消化液清洗培养瓶，添加培养液终止消化，培养液和消化液倒入离心瓶离心，取离心完成的沉淀添加冻存液混匀，所得的细胞悬液加入冻存管，放置在程序降温盒内降温12h，转入液氮。

可选的，所述干细胞的复苏的具体步骤包括：