[发明专利]改良的Csy4序列、改良方法及应用

说明书

本发明公开了一种改良的Csy4序列、改良方法及其在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用，以提高Csy4序列在斑马鱼中的表达效率。

技术领域

本发明涉及改良的Csy4序列、改良方法及其在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

利用ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9技术已经在多个物种中实现了单个基因的定向敲除，但是，对于家族基因、基因之间相互作用及多基因调控相关方面的研究，需要在一个个体中对两个甚至多个基因同时进行研究，这时候多基因突变体的获得就显得尤为重要。通过基因编辑技术进行单基因多次编辑或单基因突变体的杂交也可以获得多基因突变体，但是工作量繁重，难度加大，而且对于一些连锁基因不能够通过杂交的方法来实现。CRISPR/Cas9技术在多基因多位点打靶方面具有很大的优势，人们相继开发了多种基于CRISPR/Cas9技术的多基因编辑技术。其中Csy4介导的多基因编辑技术是发展较快应用较广的一种。

Csy4又称为Cas6f，是在原始CRISPR/Cas9系统crRNA生成过程中行使功能的一种RNA酶，但是这种RNA酶的特别之处在于，其只能识别并切割一种特异性的RNA序列，而且在这种序列的特定位点进行切割（Haurwitz et al., 2012）。Csy4的这种特异性正是其被用于多基因编辑的基础。U6启动子驱动Csy4靶序列与两个甚至多个sgRNA间隔串联表达，被Csy4靶序列隔开的多个sgRNA能够被Csy4蛋白切割形成多个有活性的sgRNA，可以实现多个基因的同时编辑（Tsai et al., 2014; Nissim et al., 2014; Wyvekens et al., 2015;Qin et al., 2015）。

斑马鱼养殖成本低廉、繁殖周期短、产卵量大，并且还有胚胎透明、体外受精以及胚胎发育同步等优点，现在人工养殖斑马鱼技术成熟，国内外实验室以斑马鱼作为模式生物在机体发育机制、遗传学、环境毒理学、免疫学、基因组等领域开展研究。但是，目前Csy4基因序列多是针对哺乳动物的密码子偏好性进行设计的，在斑马鱼中表达效率低，阻碍了Csy4在斑马鱼多基因敲除中的进一步应用，为了解决这一问题，我们对Csy4基因进行了优化，提高了Csy4在斑马鱼多基因敲除中的效率。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种改良的Csy4序列、改良方法及其在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用，以提高Csy4序列在斑马鱼中的表达效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种改良的Csy4序列，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，在改良的Csy4序列起始密码子的5’端增加了Kozak序列，Kozak的碱基序列为：gccgccacc。

优选地，在Kozak序列的5’端增加了β-globin 5’ mRNA序列，β-globin 5’ mRNA的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

一种改良的Csy4序列的改良方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）根据密码子的偏好性、GC含量、mRNA二级结构及顺势作用元件，对Csy4序列进行优化改良；

（2）在改良的Csy4碱基序列的起始密码子的5’端增加了Kozak序列：gccgccacc，同时，为了增加mRNA的稳定性，在Kozak序列5’端增加了β-globin 5’mRNA序列，优化后的Csy4称之为GKCsy4，GKCsy4的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）方便载体构建，在GKCsy4序列两端分别添加ClaI和AvaI酶切位点。

本发明的目的是提供一种改良的Csy4序列在斑马鱼中的优化及在多基因敲除中的应用。