[发明专利]竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物及其应用

说明书

本发明公开了竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物及其应用，属于分子生物学技术领域。本申请设计了29对特异性竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.58所示，产物平均片段约3.7kb，以Sanger测序法进行测序和拼接验证，其结果与通过提取叶绿体DNA进行高通量测序的结果一致，得到竹柏叶绿体基因组序列长度为133724bp，长叶竹柏的叶绿体基因组序列为133777bp。表明本发明引物重复性好，能够特异性的扩增出竹柏与长叶竹柏叶绿体基因组，有利于通过叶绿体基因组研究竹柏与长叶竹柏叶的系统进化、亲本分析、品种鉴定、系统地理学等。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地说，涉及竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物及其应用。

背景技术

竹柏(Nageia nagi)和长叶竹柏(Nageia fleuryi)是罗汉松科(Podocarpaceae)集观赏、药用、生态为一体的珍稀濒危植物，广泛分布在中国南方及日本等地。罗汉松科是松柏类植物中形态分化最为多样的类群，虽然对其起源与系统发育关系已经有了一定认识，但竹柏类植物的系统进化位置仍存在争议。叶绿体是绿色植物光合作用的重要场所，作为半自主性细胞器，其基因组具有高度保守的结构和组成，广泛应用于系统进化、亲本分析、品种鉴定、系统地理学等研究。

DNA测序技术的发展对植物分子生物学具有巨大的推动作用。1977年，Sanger发明的双脱氧核苷酸末端终止法，是第一代测序技术的基石，在此基础上逐渐发展出以ABI3730xl为代表的第一代测序平台，使得通过克隆测序或改良后的克隆测序方法获得叶绿体全基因组成为可能。1986年，烟草(Nicotiana tabacum L.)和地钱(Marchantiapolymorpha L.)叶绿体全基因组序列的公布第一次揭示了叶绿体的结构特征。截止2019年12月，已有上千个物种的叶绿体基因组序列在GenBank上公布，其中包括超过300种作物和林木的叶绿体全基因组，并仍呈快速发展趋势。

叶绿体基因组序列用于物种的进化研究最早是利用单个基因或者基因间隔的核苷酸多态性进行分析，后来发展为多个基因进行叠加分析，但多个基因的联合分析不能解决某些进化关系较为复杂的科属间的分类。Leebens-Mack等提出要想获得更加精准的系统进化树要增加基础分析的数据量即增加物种的叶绿体全基因组序列。叶绿体基因组包含大量的遗传信息，其大小适中，便于测序，且叶绿体DNA的核苷酸置换率适中，编码区和非编码区的分子进化速度有明显差异等特征可以应用于不同阶层的系统学研究。目前，基于序列分析的方法在研究叶绿体系统发育基因组学中的应用较为广泛，与传统分子系统学研究方法一致。此外，叶绿体基因组编码区的信息可以较好的区分较高分类阶元的系统进化关系，而叶绿体全基因组的序列比对可以较好的解决较低阶元分类群，如亚科下、属下分类阶元等。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物；本发明所要解决的另一技术问题是提供竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

竹柏和长叶竹柏叶绿体基因组PCR扩增引物，包括29对引物，所述29对引物的核苷酸序列如下：

cpl正向引物如SEQ ID NO.1所示；cp1反向引物如SEQ ID NO.2所示；

cp2正向引物如SEQ ID NO.3所示；cp2反向引物如SEQ ID NO.4所示；

cp3正向引物如SEQ ID NO.5所示；cp3反向引物如SEQ ID NO.6所示；

cp4正向引物如SEQ ID NO.7所示；cp4反向引物如SEQ ID NO.8所示；

cp5正向引物如SEQ ID NO.9所示；cp5反向引物如SEQ ID NO.10所示；