[发明专利]5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用。本发明通过优化出发菌株中5‑氨基乙酰丙酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的RBS序列，使得菌株的产5‑氨基乙酰丙酸能力大幅提高，适用于大规模生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一株高产5-氨基乙酰丙酸的重组菌株，以及该菌株的构建方法和应用。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB₁₂等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。近年来，利用微生物经C4途径发酵生产ALA已经得到了产业化应用。

随着代谢工程技术的不断发展，采用代谢工程手段构建ALA生产菌株的研究越来越多，其菌株的产量也有所提高。然而现有菌株产ALA的生产水平仍较低，目前文献报道的产ALA产量大都停留在几克级左右，少数文献报道的产量达到十几克，例如Yang P et al.报道的两阶段发酵工艺生产ALA，产量14.7 g/L(Yang P et al., Applied andEnvironmental Microbiology 2016,82:2709–2717)；Zhu CC et al报道的ALA生产工艺产量为11.5 g/L（Zhu CC et al.,Biotechnology and Bioengineering 2019,116:2018–2028）。但是现有产ALA的方法产量仍然较低，本领域急需生产水平更高、原料利用范围更广的菌株，以便降低生产成本，大规模推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的微生物及其构建方法，还在于提供利用本发明的微生物制备5-氨基乙酰丙酸的方法。首先，本发明提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的微生物，所述微生物中5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemA）的活性相比于未修饰的菌株增强。

在本发明的实施方式中，所述微生物包括带有RBS序列的5-氨基乙酰丙酸合成酶编码基因片段，所述RBS序列如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的实施方式中，所述微生物进一步包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）活性增强，例如所述微生物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因片段带有SEQ ID NO.12-17所示的任一种的RBS序列。在一个实施方式中，所述生产5-氨基乙酰丙酸的微生物中5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemA）活性增强，并且烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强；上述两种酶的活性增强通过优化RBS序列实现，例如所述菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶编码基因片段带有如SEQ ID NO.12所示的RBS序列，且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因片段带有SEQ IDNO.12-17所示的任一种的RBS序列。

在本发明的实施方式中，所述微生物为重组微生物；在一个实施方式中，所述微生物为重组的棒状杆菌，例如重组的谷氨酸棒杆菌。具体地，所述微生物是以野生型微生物或其他经基因修饰的微生物为出发菌株进一步进行基因修饰所得的重组微生物。

本发明还提供所述生产5-氨基乙酰丙酸微生物的构建方法：包括在微生物菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因片段中引入SEQ ID NO.12所示的RBS序列；任选地，进一步将烯醇式丙酮酸羧化酶基因片段所带有的RBS序列替换为SEQ ID NO.12-17所示的任一种。

在本发明的实施方式中，所述RBS序列的引入或者替换可采用本领域已知的方法实现，例如采用同源同组、基因编辑等方法引入或替换出发菌株中的RBS序列。

在本发明的实施方式中，所述构建方法包括：