[发明专利]敲除斑马鱼slc26a4基因的方法

说明书

本发明涉及基因敲除技术领域，尤其涉及敲除斑马鱼slc26a4基因的方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼slc26a4基因上设计合适的打靶位点，在体外合成特异性sgRNA和Cas9‑mRNA用于斑马鱼的基因编辑。本发明能更高效且更精确地沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，本发明还提供了基因敲除选育slc26a4基因缺失型斑马鱼的方法，该方法构得的斑马鱼模型，有助于进一步揭示人类大前庭水管症发生的整个过程以及调控这个过程的分子机制，在医学上对前庭水管症病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，尤其涉及敲除斑马鱼slc26a4基因的方法。

背景技术

slc26a4基因位于斑马鱼第4号染色体上，包含20个外显子和19个内含子， cDNA全长2390bp，编码760氨基酸，slc26a4编码一种阴离子转运膜蛋白，即 pendrin蛋白。pendrin蛋白是阴离子转运家族slc26中的一员，主要介导Cl-，HCO3-,OH-,I-和甲酸盐的转运，SLC26A4基因突变与Pendred综合征(PDS)(前庭水管扩大或伴内耳畸形神经性聋和甲状腺肿)和大前庭水管综合征(EVA)有密切的关系，发现slc26a4在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是内耳中强烈表达。

斑马鱼与人类内耳发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且slc26a4 基因进化上较为保守，研究发现slc26a4在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。因此，通过干扰掉斑马鱼体内的slc26a4基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示人类大前庭水管症发生的整个过程以及调控这个过程的分子机制，在医学上对前庭水管症病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。

但是目前通用的检测CRISPR/Cas9突变方法应用于斑马鱼的基因敲除存在一定的缺陷，例如：在F0代对斑马鱼进行剪尾，并且做TA克隆，Sanger测序，需要花费大量的时间、试剂以及测序成本，并且F0代测序得到的不一定能够遗传到下一代。并且，CRISPR/Cas9技术所需的步骤较多，成本太高，脱靶率相对也较高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供敲除斑马鱼slc26a4基因的方法，该方法采用cloning free策略进行斑马鱼slc26a4基因的敲除，脱靶率较低。

本发明提供了靶向斑马鱼slc26a4基因的gRNA，包括启动子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

本发明所述启动子元件的序列如SEQ ID NO:3所示；所述骨架序列如 SEQ ID NO:4所示。

在一些具体实施例中，所述靶向斑马鱼slc26a4基因的gRNA包括SEQ ID NO:5～6所示的两条gRNA。