[发明专利]敲除斑马鱼slc26a4基因的方法在审
| 申请号： | 202010053090.6 | 申请日： | 2020-01-17 |
| 公开（公告）号： | CN111154758A | 公开（公告）日： | 2020-05-15 |
| 发明（设计）人： | 谢鼎华;赖若沙;谢华平;付贵芳;杨曙;曾婷;谢缤灵;邓慧玲;胡昱瑶 | 申请（专利权）人： | 中南大学湘雅二医院 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027;A01K67/02 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 温可睿 |
| 地址： | 410000 湖南*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 斑马 slc26a4 基因 方法 | ||
1.靶向斑马鱼slc26a4基因的gRNA，包括启动子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所示的gRNA，其特征在于，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO:3所示；所述骨架序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所示的gRNA，其特征在于，包括SEQ ID NO:5～6所示的两条gRNA。
4.靶向斑马鱼slc26a4基因的敲除试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的gRNA和Cas9 mRNA。
5.根据权利要求4所述的敲除试剂，其特征在于，敲除试剂中包括Nuclease free H2O和如下浓度的：
MgCl2 10mmol/L；
Cas9 mRNA 150ng/μL；
gRNA 各20ng/μL。
6.权利要求4或5所述的敲除试剂在构建slc26a4基因缺失型斑马鱼模型中的应用。
7.一种构建slc26a4基因缺失型斑马鱼模型的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的敲除试剂接入一细胞期的斑马鱼受精卵内，孵化获得slc26a4基因缺失型斑马鱼模型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每个受精卵给予1.5～2.0nL权利要求4或5所述的敲除试剂。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述孵育后还包括筛选的步骤；所述筛选包括：对受精36h后的胚胎进行筛选，或对成鱼进行筛选；
所述筛选包括对基因组DNA进行扩增后进行Sanger测序或根据电泳结果进行筛选；扩增产物包含473bp和328bp大小的条带则slc26a4基因缺失，扩增产物仅有473bp大小的片段则slc26a4基因未缺失；所述扩增的引物序列如SEQ ID NO:7～8所示。
10.根据权利要求7～9任一项所述的方法，其特征在于，所述孵化获得的slc26a4基因缺失斑马鱼为F0代；所述方法还包括传代的步骤；
F1代斑马鱼由F0代斑马鱼与野生型的斑马鱼杂交获得；
F2代斑马鱼由F1代突变体杂交获得。
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