[发明专利]国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种国兰原生质体制备及基因瞬时表达的方法及其应用。本发明通过将国兰的花瓣或叶片酶解，得到的原生质体加入W5溶液中处理，MMG溶液重悬原生质体，得到纯化的原生质体与含有目的基因的重组质粒混匀，PEG‑CaCl₂溶液处理，W5溶液终止反应，加入WI溶液避光培育，得到可检测基因瞬时表达水平的原生质体。本发明的方法得到的原生质体率和活性率最高可达3.32±2.21(10⁷/g FW)和94.66±7.28(％)，瞬时转化效率最高可达76.06±4.51(％)，可运用于花器官特征决定相关基因CsAP3和CsAP3的亚细胞定位和BiFC蛋白互作研究，为国兰功能基因组学研究提供了新方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种国兰原生质体瞬时表达系统及其构建方法与应用。

背景技术

兰科植物(Orchidaceae)是被子植物中最大科之一，其多数地生种原产中国，又称国兰，有两千多年的栽培历史。国兰(Chinese Cymbidium)是中国十大传统名花之一，具有浓厚的文化内涵、观赏价值和经济价值。但国兰生长周期长，转基因困难，严重阻碍了其分子生物学研究进程。因此，发明一种简单、高效的针对国兰的原生质体分离及瞬时转化技术方法具有重要意义。

原生质体是去除细胞壁由质膜包裹的细胞，具有细胞全能性，可再生成完整的植株。植物原生质体分离及瞬时转化技术是一种新近发展的分子生物学研究手段。研究人员已经陆续从玉米、水稻、大豆、木薯、葡萄、百合和梅花等植物中成功分离出原生质体，并广泛应用于蛋白亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA-蛋白互作、启动子分析以及植株再生等领域。拟南芥、烟草和水稻等模式植物的原生质体分离及瞬时表达技术较为成熟，但国兰和其他非模式植物的相关研究却少有报道。

原生质体的制备效率受物种类型、材料来源、酶解液中酶种类、酶浓度和比例、渗透压调节物质(甘露醇)的浓度以及酶解时间等条件的影响。观赏植物常选用花瓣作为原生质体制备的材料(如蝴蝶兰、百合和梅花等)，瞬时表达相关基因进行蛋白互作和表达调控相关研究能更真实地反应花细胞的表达调控模式。因此，对各个影响原生质体分离的酶解条件进行优化才能制备高浓度、高活性的植物原生质体。相对于稳定的基因表达技术(转基因等)，瞬时表达技术具有成本低、操作简单、周期短等优点。较高的原生质转化效率是基因在原生质体中瞬时高效表达的基础，是基因表达调控和蛋白-蛋白互作等相关基因功能分析的保障。聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)介导的方法是原生质体质粒DNA转化最常用的方法，而原生质体活力与浓度、质粒DNA的浓度、PEG终浓度以及转化时间等均会影响转化效率。因此，需对各个转化相关条件进行优化，才能保证相关基因的瞬时高效地表达。

目前，还没有简单、高效的国兰的原生质体分离及瞬时转化技术方法见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种国兰原生质体瞬时表达系统的构建方法，包括如下步骤：

(1)采集国兰的花瓣或者叶片，切成细丝，放入酶解液中酶解2～6h，得到原生质体；

(2)将等量的W5溶液加入步骤(1)所述的酶解液中，过滤，离心，弃上清，加入W5溶液，0～4℃静置30min，弃上清，用MMG溶液重悬沉降的原生质体，得到纯化的原生质体；

(3)将步骤(2)中纯化的原生质体采用MMG溶液调整浓度，与预冷的含有目的基因的重组质粒混匀，加入PEG-CaCl₂溶液处理5～20min，加入W5溶液终止反应；

(4)离心，弃上清，加入WI溶液，22～24℃避光孵育12～24h，得到国兰原生质体瞬时表达系统。

步骤(1)中所述的国兰优选为墨兰；更优选为墨兰品种白墨。