[发明专利]一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，其特征在于，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、蛋白类载体和纳米微球的重量比为2：0.75：1；所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过高分子材料进行包裹；所述高分子材料为阿拉伯胶和木质素，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.25：1；

所述蛋白类载体为破伤风类毒素；

所述猪巴氏杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：

S1、将猪巴氏杆菌接种于装有500mL BHI液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床中振荡8～12h，振荡条件为28℃、160rpm，进行扩大培养，制得培养液A；

S2、低温离心培养液A，将离心所得沉淀用PBS缓冲液溶解并高压蒸汽灭菌，制得灭菌液B；

S3、将灭菌液B的上清液过滤，制得悬浮液C；

S4、向悬浮液C中加入1/2体积的十六烷基三甲基溴化铵，充分搅拌后4℃静置过夜，离心，收集沉淀物，得到复合多糖；

S5、将复合多糖溶入2mol/L氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清液，向上清液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天，离心收集沉淀，沉淀溶于水，进行除蛋白、透析和冻干，制得猪巴氏杆菌荚膜多糖。

2.如权利要求1所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，其特征在于，所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

S1、磁性微粒的制备：称取FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O分别溶解于去离子水中，配制成Fe²⁺浓度为0.2mol/L的溶液A和Fe³⁺浓度为0.125mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮时，停止加入氢氧化钠，继续搅拌30min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌1h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；

S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积加入，超声活化30min后，置于60℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者比例为0.25：1，在N₂保护下搅拌反应10h，制成纳米微球。

3.一种如权利要求1所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应18h，反应结束后进行透析，除去未反应纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；

S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应7h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；

S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体以及破伤风类毒素，共反应24h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。