[发明专利]一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法

权利要求书

1.GREM1在筛选具有促骨生成的间充质干细胞中的应用。

2.一种筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：检测间充质干细胞中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞，得到具有促骨生成能力的间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养间充质干细胞，然后处理间充质干细胞，得到间充质干细胞的待检测样品；

(2)利用吸光度法测定步骤(1)中处理过的间充质干细胞的待检测样品的中GREM1的浓度，筛选GREM1浓度在5.37μg/ml以上的间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：

①培养间充质干细胞，当间充质干细胞长满细胞培养瓶50％～60％时，分别弃掉培养基，按照实验体系更换成无血清的基础培养基继续培养细胞48h，然后收上清液，离心，收上清液，弃沉淀；最后将上清液样品冻存于-80度备用；

②分别采用包被好的GREM1ELISA试剂盒，加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；在酶包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，轻轻晃动混匀；

③温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟；

④配液：将n倍浓缩洗液用蒸馏水n倍稀释后备用，n为任意正数；

⑤洗涤：揭掉封板摸，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复数次，拍干；

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

⑦显色：每孔加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

⑧终止：每孔加终止液50μl，终止反应，得到间充质干细胞的待检测样品。

5.根据权利要求3所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，促骨生成的间充质干细胞的培养氧浓度为1-5％。

6.根据权利要求5所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，在1-5％氧浓度下培养间充质干细胞，筛选间充质干细胞的GREM1的基因相对表达量为常氧浓度的8.8倍以上的间充质干细胞。

7.根据权利要求2-5任一所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的倍增时间在25h以下。

8.根据权利要求7所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)培养间充质干细胞，连续检测多天细胞倍增数目，每天在固定时间进行细胞消化，计数；

(2)根据公式计算倍增时间，

PDT＝(ΔT×log2)/(logNt-logN0)，

其中，PDT为细胞倍增时间，ΔT为隔天数，Nt为对数生长期任一点的理论观察者，N0为对数生长期理论初始值，N0在接种细胞24小时后进行计算群体倍增时间；

筛选出细胞倍增时间小于25h的间充质干细胞。

9.根据权利要求8所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：

①将消化下来的间充质干细胞，对细胞进行6孔板铺板，细胞数为：5×10³个/孔，每孔总体积v＝2ml/孔；

②连续检测6天细胞倍增数目，每天进行三个复孔重复实验；

③每天在指定时间点进行细胞消化，细胞仪计数，并比较三个复孔间的细胞数；

④待6天细胞群数目检测完毕，统计数据。

10.权利要求2-9任一所述的筛选具有促骨生成的间充质干细胞的方法得到的间充质干细胞在制备治疗骨病的药物中的应用。