[发明专利]一种去除PK15细胞中支原体的方法

说明书

本发明公开了一种去除PK15细胞中支原体的方法，具体包括以下步骤：(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；(2)将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，加入细胞生长液进行传代；(3)加入Plasmocin treatment试剂，继续培养；(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocin treatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。本发明能够有效去除PK15细胞中的支原体，且用时较短，获得的无支原体的PK15细胞在后期传代过程中无需再使用Plasmocin treatment试剂，也不会发生细胞的二次感染。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种去除PK15细胞中支原体的方法。

背景技术

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。目前对细胞的支原体去除方法多是用不同抗生素进行去除，比如氟喹诺酮类、四环素类衍生物、大环内酯类抗生素，其处理方法为：(1)获取待处理的细胞；(2)用含10μg/ml环丙沙星的培养基培养所述待处理的细胞；(3)定时更新所述培养基，并且使所述待处理的细胞的生长密度保持在50％～80％；(4)检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基。这些抗生素在使用一段时间后细胞支原体变成阴性，但细胞在不添加这些抗生素继续传代十几代后，支原体检测又变成的阳性。

支原体约有1％可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，因此在普通光学显微镜下不易被发现。商品化的Plasmocin(支原体抗生素)主要用于治疗或预防细胞培养中支原体污染。Plasmocin含有两种杀菌成分，可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌。它的显著效果主要是其含有两种独特的抗菌成分，一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻，另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制，而这两种成分的靶分子只存在于支原体和许多其他细菌中而并不存在于真核细胞中。0.1μm滤菌器过滤后，不能彻底截留支原体；而过高浓度的Plasmocin可能对细胞产生伤害，并且若培养基、添加剂本身就有支原体污染，单独采用Plasmocin去除效果不明显。所以单使用上述任何一种方法都不能保证彻底清除支原体。

发明专利CN 104073472 A公开了一种去除PCV2病毒中支原体污染的方法，该种去除PCV2病毒中支原体污染的方法包括步骤：0.1μm滤菌器过滤PCV2病毒并繁殖四代，PCV2病毒用终浓度2.5μg/ml的Plasmocin处理两代，常规繁殖PCV2两代。该专利采用先过滤再用抗生素的方法，不仅节省了实验成本，更为重要的是抗生素使用次数少，浓度小，去除支原体时间短，整个处理过程仅需8代，约16～20天可完成，且不会使PCV2病毒效价降低，可为疫苗生产提供无支原体且病毒效价高的PCV2病毒，并为单位体积内疫苗半成品病毒含量的提高提供了保障。但是，常规的细胞培养一般是用透气细胞瓶或者密封的细胞瓶将瓶塞松开一点口，保持细胞通透性，但这样做在环境中有支原体的情况下，容易使支原体进入细胞瓶，进而感染瓶内细胞。为此，我们寻找一种能有效去除PK15细胞的支原体方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明通过提供一种去除PK15细胞中支原体的方法，以便能够有效去除PK15细胞中的支原体。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种去除PK15细胞中支原体的方法，具体包括以下步骤：

(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；