[发明专利]一种去除PK15细胞中支原体的方法在审
| 申请号： | 201810631750.7 | 申请日： | 2018-06-19 |
| 公开（公告）号： | CN108753684A | 公开（公告）日： | 2018-11-06 |
| 发明（设计）人： | 郭春丽;王学波;刘志亮;王丹娜;常娓娓;罗济冠;李晓林;王相芹;李朝阳 | 申请（专利权）人： | 山东信得科技股份有限公司;青岛信得药业有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12M1/12 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 262200 山东省潍坊市*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 传代 支原体 去除 细胞生长液 培养基 二次感染 连续传代 胰酶消化 致密单层 滤菌器 牛血清 再使用 单层 分装 灭活 胰酶 用时 制备 备用 过滤 配制 消毒 细胞 配置 | ||
1.一种去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)分别配置DMEM培养基和0.25％胰酶，然后经滤菌器分别进行过滤，将牛血清进行消毒和灭活处理后进行分装备用；
(2)将步骤(1)处理分装的牛血清加入到DMEM培养基中配置成细胞生长液，将长满单层的PK15细胞用步骤(1)制备的0.25％胰酶消化分散，按照1:5比例加入细胞生长液于不透气的T25细胞培养瓶中进行传代；
(3)向步骤(2)获得的T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocin treatment试剂，继续培养；
(4)待PK15细胞长成致密单层后进行传代，选用含有25μg/ml的Plasmocin treatment试剂的步骤(2)中配制的细胞生长液作为传代培养基，待PK15细胞长满后按1:5加入所述的传代培养基再连续传代4代，即获得无支原体的PK15细胞。
2.根据权利要求1所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述滤菌器的规格为0.1μm。
3.根据权利要求2所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述牛血清经钴60照射消毒，然后在56℃、30分钟条件下灭活处理后分装备用。
4.根据权利要求3所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(1)中，经滤菌器分别过滤后，需经PCR分别检测所述的DMEM培养基、0.25％胰酶均为阴性；灭活后的牛血清也为支原体阴性。
5.根据权利要求1所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述细胞生长液中牛血清含量为8％。
6.根据权利要求1所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：步骤(3)中，按照1000:1的体积比向T25细胞培养瓶内的细胞悬液中加入Plasmocin treatment试剂；继续培养的条件为在密封状态下置于37℃恒温培养箱中培养。
7.根据权利要求1‐6任一项所述的去除PK15细胞中支原体的方法，其特征在于：经由步骤(4)制备获得的所述的无支原体的PK15细胞在传代使用时，需要使用步骤(1)制备的不含支原体的DMEM培养基、牛血清和0.25％胰酶，且需要在密封状态下培养，但是无需加入Plasmocin treatment试剂。
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