[发明专利]一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法

说明书

本发明公开了一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，弹性蛋白原料来源于牛筋然后用碱性蛋白酶进行水解，再通过高温灭酶、超滤浓缩、离子交换树脂吸附、超声波辅助亲和反胶束提纯得到含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽。本发明制备条件温和、提取选择性高、产品纯度高、易于连续化生产。

技术领域

本发明涉及一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

牛筋，是牛脚掌部位的块状筋腱，也就是附在牛蹄骨上的韧带，富有韧性，牛筋属于中药药材之一。《本草从新》提到：补肝强筋，益气力，续绝伤。。

弹性蛋白，是一种重要的细胞外基质蛋白，是弹性纤维的重要组成部分，主要存在于韧带和脉管壁，主要功能是被动伸缩，赋予所在组织和器官伸缩和可逆的变形能力。弹性蛋白是一种极难溶的硬蛋白，不溶于稀酸、碱、醇和盐溶液。弹性蛋白的弹性性能和延展性能使其在生物医用材料领域例如组织工程支架、真皮替代物等有重要的应用。

弹性蛋白酶，从动物胰脏中提取得到，是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，分解机制是先使蛋白质结构松散溶解，然后对氨基酸残基进行水解，使已溶解的蛋白质分解为可溶性多肽和氨基酸。目前弹性蛋白酶的分离提取分类两类：一类是将猪胰脏提取液通过硫酸铵盐析法，再经结晶或层析等方法获得；另一类是将猪胰脏提取液用多种离子交换树脂分离精制得到。步骤繁琐，生产效率低下。

弹性蛋白肽，是弹性蛋白经酶解处理后得到的小分子蛋白肽。弹性蛋白肽被广泛应用于保健品领域；弹性蛋白肽对角质形成细胞分化有明显的促进作用，在皮肤肿瘤、皮肤损伤修复等过程中发挥重要作用，已被应用于生物医药领域；另外弹性蛋白肽又具有抗氧化性，能够清除超氧阴离子自由基抗氧化性，因此弹性蛋白肽在化妆品领域也具有广阔的应用前景。目前弹性蛋白肽多采用超滤法制备，纯度低，杂质较多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，具有条件温和、提取选择性高、产品纯度高、易于连续化生产等优点。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，弹性蛋白原料来源于牛筋然后用碱性蛋白酶进行水解，再通过高温灭酶、超滤浓缩、离子交换树脂吸附、超声波辅助亲和反胶束提纯得到含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽。

在上述方案中优选的是，包括以下各步骤：

(1)清洗：去掉牛皮和脂肪得到新鲜牛筋，绞碎后用生理盐水洗涤；

(2)水解：向所述牛筋中加入丙酮并搅拌，离心得到沉淀物；再加入碱性蛋白酶和水搅拌溶解，再加入保护剂海藻酸钠、山梨酸钾和苯甲酸钠，最后用NaOH调整PH；保温振荡；

(3)高温灭酶：将步骤(2)所得混合液加热，灭酶活性；用NaOH调节PH，然后静置；

(4)超滤浓缩：将步骤(3)所得反应液先用截留分子质量为500-700kDa的超滤膜过滤，得到滤出液；再用10-30kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩，保留即弹性蛋白肽粗提液；

(5)离子交换树脂吸附：把步骤(4)超滤得到的弹性蛋白肽粗提液经过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行富集，即用醋酸钠缓冲液洗涤，再用醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱，收集洗脱液；

(6)超声波辅助亲和反胶束提纯：先建立反胶束萃取体系：选用异辛烷为溶剂，丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠(AOT)为表面活性剂，加入适量醋酸钠缓冲液搅拌混匀，静置，溶液呈透明状；然后将步骤(5)中的洗脱液加入建立好的反胶束萃取体系内，在超声波辅助下进行亲和反胶束提纯操作，收集反萃取水相；

(7)喷雾干燥：将步骤(6)得到的水相经过喷雾干燥机快速干燥得到粉状弹性蛋白肽制剂。