[发明专利]一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法

权利要求书

1.一种制备含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽的方法，其特征在于：弹性蛋白原料来源于牛筋然后用碱性蛋白酶进行水解，再通过高温灭酶、超滤浓缩、离子交换树脂吸附、超声波辅助亲和反胶束提纯得到含多种特有氨基酸的弹性蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下各步骤：

(1)清洗：去掉牛皮和脂肪得到新鲜牛筋，绞碎后用生理盐水洗涤；

(2)水解：向所述牛筋中加入丙酮并搅拌，离心得到沉淀物；再加入碱性蛋白酶和水搅拌溶解，再加入保护剂海藻酸钠、山梨酸钾和苯甲酸钠，最后用NaOH调整PH；保温振荡；

(3)高温灭酶：将步骤(2)所得混合液加热，灭酶活性；用NaOH调节PH，然后静置；

(4)超滤浓缩：将步骤(3)所得反应液先用截留分子质量为500-700kDa的超滤膜过滤，得到滤出液；再用10-30kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩，保留即弹性蛋白肽粗提液；

(5)离子交换树脂吸附：把步骤(4)所得到的弹性蛋白肽粗提液经过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行富集，即用醋酸钠缓冲液洗涤，再用醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱，收集洗脱液；

(6)超声波辅助亲和反胶束提纯：先建立反胶束萃取体系：选用异辛烷为溶剂，丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠为表面活性剂，加入适量醋酸钠缓冲液搅拌混匀，静置，溶液呈透明状；然后把步骤(5)得到的洗脱液加入建立好的反胶束萃取体系内，在超声波下进行亲和反胶束萃取操作，收集反萃取水相；

(7)喷雾干燥：把步骤(6)所得水相经过喷雾干燥机快速干燥得到粉状弹性蛋白肽制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中新鲜牛筋绞碎后用0.8-1.0％生理盐水洗涤2-3次。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中丙酮与牛筋的比例为2-4L：1kg；牛筋、碱性蛋白酶与水的比例为1：1-3：5；再分别按混合溶液质量的2-5％、3-6％及0.1-0.4％加入固体保护剂海藻酸钠、山梨酸钾及苯甲酸钠；再用6％NaOH溶液调节PH至7.0-9.0；于20-30℃下培养12-36h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中将上一步所得液置于85-115℃下加热20-30min，灭酶活性；用6％溶液浓度的NaOH调节PH至7-9，然后在15-25℃下静置20-30h。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中将上一步反应液先用截留分子质量为500-700kDa的超滤膜过滤，得到滤出液；再用截留分子质量为10-30kDa的超滤膜过滤，滤液在38-42℃下旋转蒸发浓缩3倍，保留滤出液。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中先将强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂装柱，自然沉降，然后将上一步超滤得到的粗提液缓慢加入交换树脂内，再用PH为4.0，0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤3柱床，接下来用相同浓度相同PH的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱2.5柱床，收集洗脱液。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(6)中先建立反胶束萃取体系：取浓度为0.08g/mL的表面活性剂丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，其以10mL异辛烷为溶剂，将其搅拌溶解；再加入一定体积的PH为4.0，3mol/L的醋酸钠缓冲液搅拌混匀，静置5-30min，溶液呈透明状；

然后将步骤(5)所得洗脱液加入建立好的反胶束萃取体系内，在20-40℃超声条件下先后进行正萃取和反萃取操作：加入洗脱液后在180r/min下振荡3-4h,然后在2000-4000r/min下离心20min后取上层丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠层得到前萃液；然后加入与前萃液等体积的1.0mol/L的醋酸钠缓冲液，PH为8.0，200r/min下振荡60min进行反萃取，然后在2000-4000r/min下离心20min，收集水相。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(7)中将滤出液经过喷雾干燥机在2000-4000r/min转速下离心15-30min干燥得到粉状弹性蛋白肽制剂。