[发明专利]结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法在审

专利信息
申请号: 201810360082.9 申请日: 2018-04-20
公开(公告)号: CN108517353A 公开(公告)日: 2018-09-11
发明(设计)人: 吴国平;赵远洋;汤凯洁 申请(专利权)人: 江西农业大学
主分类号: C12Q1/6844 分类号: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/06;C12R1/19
代理公司: 北京君智知识产权代理事务所(普通合伙) 11305 代理人: 田燕
地址: 330045 江西省南*** 国省代码: 江西;36
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摘要:
搜索关键词: 检测样品 蒙脱石 叠氮溴化乙锭 聚合酶活性 活性炭 活菌检测 食品样品 抑制剂 封闭 活性炭去除 反应结果 肉类样品 样品提取 灵敏度 前处理 检测 活菌 消减 增菌 精制 耗时 应用
【说明书】:

发明提供一种结合蒙脱石封闭活性炭的EMA‑Rti‑LAMP的活菌检测方法,先以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂,然后加入叠氮溴化乙锭进行反应,再对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板;再进行Rti‑LAMP扩增反应,根据反应结果获取活菌数量。本发明的检测方法通过BCAC消减检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂,结合EMA‑Rti‑LAMP检测方法对非预增菌的经过前处理精制的检测样品,能够在5h内从食品样品中检测低至5CFU/g活的E.coli O157:H7,适用于肉类样品和蔬菜类样品,也可应用于其他类食品样品,具有操作简便、耗时短、快速可靠、灵敏度高。

【技术领域】

本发明属于生物检测领域,具体涉及结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)、EMA(ethidium bromide monoazide)及实时荧光环介导等温扩增技术(Rti-LAMP)实现快速特异性活菌检测。

【背景技术】

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌中最常见的血清型,也是其多种血清型中最主要的致病菌株,感染剂量低于5CFU。感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorhabic colitis,HC),还可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremicsyndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,致死率达5%~10%。

目前检测E.coli O157:H7的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子生物学检测。这些方法在不同的检测要求下都有各自的优点,但是也都存在着一定的不足,比如耗费时间长、操作过程繁琐以及检测灵敏度低等。环介导等温扩增技术自2000年日本科学家Notomi发明报道以来,因其可在等温条件下数十分钟内完成核酸的高倍扩增,从而成为继PCR技术之后又一新型更快速、简便的分子生物学检测技术。目前各国研究人员在此基础上发展出了多种病原菌的LAMP检测方法。与PCR等其他方法相比,LAMP有着其独特的优点,如在等温条件下即可完成扩增反应、反应时间短(40-60min)、灵敏度比较高、而且反应温度比较低(60-65℃),甚至可肉眼直接判断反应结果。

然而这种基于核酸扩增的分子生物检测方法不能区分活、死细胞,因而无法准确定量检测样品中活菌浓度。叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)能够穿透破损的细胞壁或细胞膜与DNA共价结合形成耦合物,使其不能发生扩增反应。本发明将EMA结合Rti-LAMP实现快速定量检测活的E.coli O157:H7。

研究表明食品中存在多种水溶性DNA聚合酶抑制剂,会干扰PCR等分子生物学方法检测食品中致病菌。活性炭是一种具有较大表面积、复杂孔隙结构的物质,具有良好的吸附性能,可以用来消减干扰PCR聚合酶活性的抑制剂。但由于活性炭同时能吸附细菌,需要对其表面进行适当封闭,从而防止细菌被吸附。本发明使用蒙脱石封闭的活性炭可以消减食品中水溶性抑制剂,同时不影响食品中细菌的回收。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种避免受干扰PCR聚合酶活性的抑制剂干扰的活菌检测方法,能够更快地实现食品检测样品中活菌的定量检测。

为了实现上述目的,本发明提供一种结合蒙脱石封闭活性炭的EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法,所述方法包括以下步骤:

(1)以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的的抑制剂,得到精制检测样品;

(2)向所述精制检测样品中加入叠氮溴化乙锭进行反应;

(3)对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板;

(4)对步骤(3)的DNA模板进行Rti-LAMP扩增反应,根据反应结果获取活菌数量。

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