[发明专利]结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法

权利要求书

1.一种结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，得到精制检测样品；

(2)向所述精制检测样品中加入叠氮溴化乙锭进行反应；

(3)对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板；

(4)对步骤(3)的DNA模板进行Rti-LAMP扩增反应，根据反应结果获取活菌数量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述蒙脱石封闭活性炭是通过以下制备方法得到的：

(1)颗粒活性炭的处理：取粒径为0.5-3mm的颗粒活性炭，用水清洗至流出的水无色清亮，烘干备用；

(2)蒙脱石封闭剂的制备：按以g/mL计取1份蒙脱石和50份去离子水，混合后高速匀浆，然后以700rpm离心1min，取上清为封闭剂，备用；

(3)蒙脱石封闭活性炭的制备：以步骤(2)的封闭剂浸没步骤(1)的颗粒活性炭，在35-40℃下摇床中100-150rpm封闭2-4h，然后弃上清，烘干后得到蒙脱石封闭活性炭。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(1)中，按以g/mL计取25份检测样品和50-100份缓冲液，均质1min后在500-800g下离心5min，取上清，用玻璃棉过滤后再在8000-12000g下离心5min，所得沉淀用20-30份缓冲液重悬，得到重悬液；取4-5份蒙脱石封闭活性炭，以缓冲液润洗后加入到重悬液中，室温下100-180rpm下吸附10-20min，随后溶液经玻璃棉过滤后8000-12000g下离心5min，所得沉淀用缓冲液重悬得到二次重悬液，所述二次重悬液为精制检测样品。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中，向所述精制检测样品加入叠氮溴化乙锭使其终浓度为4-8μg/mL，黑暗处理5min后，然后置于卤素灯下处光照10-20min，然后在12000g下离心10-15min，所得沉淀用1×TZ裂解液重悬，沸水浴加热10min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(4)中，所述Rti-LAMP的反应体系总量为25μL，所述反应体系包括：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(4)中，根据Rti-LAMP反应结果，设定Rti-LAMP出现指数扩增时荧光值500处的时间为Tt值，建立Tt值与目标菌浓度的标准曲线，然后根据标准曲线定量检测样品中活菌浓度。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测样品为食品。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述食品是肉类或蔬菜。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述活菌是大肠杆菌O157:H7。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于所述大肠杆菌O157:H7的检测引物包括：

内引物FIP：GCT-CTT-GAT-GCA-TCT-CTG-GTA-CAC-TCA-CTG-GTT-TCA-TCA-TAT-CTG-G；

内引物BIP：CTG-TCA-CAG-CAG-AAG-CCT-TAC-GGA-CGA-AAT-TCT-CCC-TGT-ATC-TGC-C；

环引物Loop F：TGT-ATT-ACC-ACT-GAA-CTC-CAT-TAA-CG；

环引物Loop B：GGC-ATT-TCC-ACT-AAA-CTC-CAT-TAA-CG；

外引物F3：CAG-TTA-TAC-CAC-TCT-GCA-ACG-TG；

外引物B3：CTG-ATT-CGC-CGC-CAG-TTC。