[发明专利]同时表达两个外源蛋白载体TRVe2

权利要求书

1.同时表达两个外源蛋白载体TRV2e²的构建方法，其特征是：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达；

依次包括以下步骤：

以质粒pYL156为模板，通过引物对P1/P2进行PCR扩增，目的产物割胶回收后经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，同时用Hind Ⅲ/EcoRⅠ对pYL156进行双酶切，割胶回收载体，与上一步所得酶切PCR产物片段连接及转化，获得重组质粒pTRV2e¹；P1和P2引物序列分别为cccAAGCTTGCATGCCTGCAG和cGAATTCtctagaCTCGAGacgcgtAAGCCACTTCCTAAGTAATTCGTGCcTTGCGAAACTCAAATGC；

PCR扩增的体系为： 5×Q5 reaction buffer 8 μL， 2.5 mM的 dNTP 3.2 μL，10 μM的P1/P2各2 μL，模板pYL156 10 ng， 1U/ μL的 Q5 polymerase 0.4 μL，ddH₂O补足至40 μL；PCR反应程序为：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35个循环，72 ℃ 5min；

豌豆早枯病毒外壳蛋白CP基因启动子序列为：gcacacaaggttaaaaacgctgtagtaatacatgcgcaagaacaggctgagcatcttgttctggggtttcacactatctttagagaaagtgttaagttaattaagttatcttaattaagagcataattatactgatttgtctctcgttgatagagtctatcattctgttactaaaaatttgacaactcggtttgctgacctactggttactgtatcacttacccgagttaacgagatct，通过人工合成并克隆于载体pUC57中；以载体pUC57-PEBV CP为模板，通过引物对P3/P4进行扩增得到PEBV CP的启动子序列，目的片段割胶回收，经MluⅠ/SmaⅠ双酶切清洁回收后，并克隆至pTRV2e¹中，获得克隆pTRV2e²；引物P3和P4分别为CGacgcgtGCACACAAGGTTAAAAACGCTGTAG和tccCCCGGGccatggGGTACCggatccTCACTGAGGTGCCTCGATG；

PCR扩增的体系为： 5×Q5 reaction buffer 8 μL， 2.5 mM 的dNTP3.2 μL ，10 μM的P3/P4各2 μL，模板pUC57-PEBV CP 10 ng， 1U/ μL的 Q5 polymerase0.4 μL，ddH₂O补足至40 μL；PCR反应程序为：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35个循环，72 ℃ 5 min。

2.如权利要求1所述方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e¹和pTRV2e²的用途，其特征是：病毒TRVe¹和TRVe²在寄主植物中不引起明显的症状；携带2个外源基因病毒TRVe²后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白；

所述TRVe¹由pTRV1和 pTRV2e¹组成，所述TRVe²由pTRV1和 pTRV2e²组成。