[发明专利]一种羟基纳米磁珠法提取RNA的试剂盒及提取方法

说明书

本发明公开了一种羟基纳米磁珠提取RNA提取试剂盒，以及快速简介的提取产菌核真菌RNA的方法。所述试剂盒包含溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液Ⅳ、洗涤液、洗脱液和羟基纳米磁珠悬浮液。本申请创新性的使用溶液Ⅱ对产菌核真菌的多糖物质进行剔除，使得在RNA提取过程中避免胞外多糖的干扰。试验过程中还创新性的对试剂盒所使用的羟基纳米磁珠进行了预处理，以RNA作为分子靶标，减少羟基纳米磁珠对DNA和蛋白质的吸附能力，该操作具有较高特异性的突出特点。该试剂盒适用于产菌核真菌的RNA提取，检测简单便捷，降低了胞外多糖对RNA提取的干扰。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种羟基纳米磁珠法产菌核真菌RNA提取试剂盒，以及特异性强快速提取产菌核真菌RNA的方法。

背景技术

菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，其功能主要是抵御不良环境。常见的产菌核真菌有菌核属和丝核菌属真菌，该类真菌含有大量的胞外多糖。而真菌胞外多糖具有高吸附高粘稠特点，是困扰产菌核真菌分离提取高纯度RNA的难点之一。随着分子生物学的快速发展，RNA相关的转录组学分析、cDNA文库的构建、Northern印迹等技术备受人们的关注，需要RNA。RNA的提取是现代分子生物学的一项基本技术，同时也是研究核酸的重要手段，而有一定纯度和完整性的RNA是影响许多分子生物学研究成功与否的关键。目前，异硫氰酸胍-酚法提取RNA是较常见的方法，其主要原理为GIT与β-巯基乙醇共同作用一直RNase的活性；GIT与十二烷基胺酸钠作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。但是针对多糖含量较高的产菌核真菌的RNA提取无法达到理想的效果。

苯酚法提取RNA的主要原理是细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基硫酸钠磺酸钠(SDS)的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧烈震荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。因DNA和RNA同在水相层中，常因为实验操作使RNA的提取混有DNA片段及其他杂质，RNA提取物达不到下一步分子生物学试验的标准。

柱式法真菌RNA提取试剂盒的发展大大提高了RNA提取的便利性。其主要原理为利用包埋有纯化填料的纯化柱对RNA分子的吸附作用，在提取过程中将RNA有效吸附在过滤膜中，再经离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对RNA的提取工作，操作速度加快，RNA浓度增加。当前，柱式法回收RNA应用广泛，但也有其自身缺陷，对于多糖物质含量较高的真菌在过滤网时常常会引起滤网的堵塞，使大量RNA片段无法吸附在过滤网上，最终导致RNA提取浓度低或者失败。

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。虽然使用Trizol可以很好的保存RNA的完整性，但是提取过程较多的样品多糖还是严重影响了RNA分离，使得到RNA提取物浓度太低，下游试验常常失败。

近年来，因纳米磁性氧化铁的特殊性，羟基纳米磁珠法在真菌RNA提取应用中越来越受到关注。其原理为羟基纳米磁珠表面修饰有特殊化学基团或者依靠巨大的表面能，可在不同条件下对RNA分子形成特异性吸附和解吸附作用，吸附在羟基纳米磁珠内的RNA分子在外加磁场作用下可与羟基纳米磁珠分离，简单便捷的完成DNA的提取工作。虽然羟基纳米磁珠法大部分真菌RNA提取的操作简便，其不足之处也是无法排除多糖物质对RNA吸附的影响。