[发明专利]一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其应用

说明书

本发明涉及一种哺乳动物细胞表达的黄花蒿主要致敏蛋白Art a3，编码基因、表达方式、纯化工艺，以及重组蛋白检测方法和应用。黄花蒿致敏蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并未见相关文献公开；而传统的提取方式常存在着成分复杂、质量难以控制、易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染等问题。为此，本发明提供了如SEQ ID NO：1所示的重组Art a3的编码基因，以及专为此设计的表达、纯化、重组蛋白检测方法及应用，与现有技术相比，本发明的重组Art a3具有较高的表达量及活性，同时也为该药品开发过程中细胞株开发、工艺优化、临床前和临床研究以及工业化生产建立了基础。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其编码基因和表达纯化方法。

背景技术

近年来过敏性花粉症的发病率呈逐年上升，欧洲的发病率由20世纪初的1％上升到了20％，并预计在未来20年内可达到35％。我国花粉症患者已逾1000万人，城市居民发病率为0.9％左右，流行区可达5％，随着城区树木花草品种越来越多，花粉过敏症患者有增加的趋势。

花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。花粉的飘散具有明显的季节性。春天的风媒花粉多来源于树木；晚春和初夏的风媒花粉多来源于牧草；夏末和秋初的风媒花粉多来源于杂草。目前已知可以引起人类过敏的花粉主要有蒿属花粉(Artemisia)、豚草属花粉(Ambrosia)、蓖麻属花粉(Ricinus)、葎草属花粉(Hummlus)、藜属花粉(Chenlpldum)、苋属花粉(Amaranthus)、木麻黄属花粉(Casuarina)、桦木属花粉(Betula)、松属花粉(Pinus)、云杉属花粉(Picea)、柳杉属花粉(Cryptomeria)、悬铃木属花粉(Platanus)等。这些植物的花粉因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广；且植物自身分布的范围广，数量亦丰富，对花粉污染的影响大，因而这些植物成为较重要的花粉污染源植物。由于花粉污染源植物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植物亦不相同。在我国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为严重。

目前，临床上主要采用黄花蒿粗提液治疗蒿属花粉过敏引起的过敏性鼻炎与过敏性哮喘等过敏性疾病的脱敏治疗，例如浙江我武生物2016年6月份批准的黄花蒿粉滴剂即为黄花蒿提取液。由于天然变应原提取液的组成非常复杂，界定其组分非常困难，提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。

而另一方面，黄花蒿变应原蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并见相关文献公开。

发明内容

为了克服以上缺点，发明人根据NCBI已公开的Artemisia vulgaris clone1Artv3allergen precursor(Art v3)的mRNA序列从NCBI EST检索获得与Art v3高度同源性但未知基因功能的Artemisia annua的cDNA序列，命名为黄花蒿3类变应原(以下简称rArta3)，并将该基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中进行了优化，在分子设计时加入了提高rArt a3表达的作用原件，发明人惊喜地发现，经过基因优化后rArt a3与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有高度相似的生物学活性，可用于花粉过敏治疗中。

本发明的一个目的是提供一种编码rArt a3蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。该序列针对哺乳动物细胞CHO表达系统进行了密码子优化，其更利于rArta3在哺乳动物细胞CHO中表达。

本发明的另一个目的是提供一种rArt a3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。