[发明专利]一种环境化学物心肌发育毒性评价技术方法

说明书

本发明属于环境化学物毒性评价技术领域，具体提供一种基于转录组测序技术分析环境化学物对人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞毒性的评价技术方法。本发明提供的人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞的方案，可以用于进行环境接触剂量或人群内暴露剂量下的环境化学物的心肌发育毒性筛查，通过本发明优化的人胚胎干细胞定向心肌细胞分化模型，可以构建环境化学物暴露致胚胎心肌发育毒性的风险评估体系，在环境化学物、药物等心肌毒性预测评估上得以推广应用，为CHD的早期预防提供理论依据，为促进儿童健康、提高人口质量做出贡献。且本发明所采用的转录组测序，可以从全基因组水平，明确环境化学物暴露所导致的胚胎心肌发育毒性。

技术领域

本发明属于环境化学物毒性评价技术领域，具体涉及是一种基于转录组测序技术分析环境化学物对人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞毒性的评价技术方法。

背景技术

先天性心脏病(CHD)简称先心病，是最常见的出生缺陷，我国新生儿发病率为0.6％-0.8％，在各种出生缺陷中占首位。我国每年有超过20万CHD患儿出生，为社会和家庭带来沉重的负担。CHD是由于心脏、血管在胚胎发育过程中的障碍所导致的心脏、血管结构和功能上的异常，可严重危害婴幼儿的健康，导致宫内流产、死胎等发生，不但影响胎儿出生后的生活质量,而且降低成年期的生存质量。孕期的前三个月是胚胎发育的重要阶段，其中心脏是机体各系统发生过程中首先形成的器官，心脏的形成开始于胚胎期第2周，至第8周房室间隔完全形成，因此第2-8周是胚胎心脏发育的关键时期，此阶段是CHD形成的风险时期。

导致CHD的原因非常复杂，少数是由于染色体异常等遗传因素所致，除此之外约80％的病因和发病机制不明确，目前一致认为是环境、基因等相互作用的结果。近年来国内外学者开始给予环境因素更多的关注，在胚胎心脏发育的敏感期内，心脏对胚胎发育环境中的变化高度敏感，孕妇暴露于不良环境因素中，胎儿可能出现心血管畸形等出生缺陷。环境化学物是一类与CHD有关的重要环境因素，外源性的化学物可通过胎盘屏障进入胎儿体内，影响胎儿的正常发育。

胚胎发育是遗传信息和环境因素相互作用产生特异表型的编程过程，胚胎从无限分化潜能的全能干细胞分化形成机体不同的组织和器官。胚胎干细胞(ESC)是检测环境化学物对胚胎心肌发育影响的良好模型。ESC是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能。ESC可分化成心脏组织的多种类型细胞，包括心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野氏细胞和窦房结样细胞等多种心肌组织细胞。ESC分化的心肌细胞和胎儿形成早期的心肌细胞在电生理、钙运作、肌原纤维结构和心肌收缩蛋白的表达等各个方面都有很大的相似性。这些特性赋予了ESC在研究心肌细胞发生发育分子机制中的重要价值，也为药物、化学物的心脏毒性检测提供了独特的模型。

外源性化学物暴露可以造成心肌分化过程中相关基因发生改变，但此方面的研究还主要停留在单基因的层面，缺乏全基因组的探讨。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，转录组研究能够从整体水平研究基因功能,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。RNA-Seq作为一种高效、快捷的转录组研究手段被广泛应用于各项研究中。

因此，迫切需要通过高通量测序方法，检测低剂量的环境化学物暴露所致的胚胎心肌发育相关的转录组变化，这对于揭示环境外源化学物暴露导致的心肌发育毒性及其机制探讨有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量测序方法，以检测低剂量的环境化学物暴露所致的胚胎心肌发育相关的转录组变化，揭示环境外源化学物暴露导致的心肌发育毒性并及其机制探讨提供依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种环境化学物对胚胎心肌发育毒性的评价技术方法，包括如下步骤：

(1)在GSK抑制剂、Wnt抑制剂的作用下优化人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞；