[发明专利]一种环境化学物心肌发育毒性评价技术方法

权利要求书

1.一种环境化学物对胚胎心肌发育毒性的评价技术方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在GSK抑制剂、Wnt抑制剂的作用下优化人胚胎干细胞定向诱导分化成心肌细胞；

(2)在干细胞向心肌细胞诱导分化的全程中，接受低剂量的环境化学物暴露；

(3)在环境化学物暴露中，采集细胞照片和心肌细胞搏动视频，通过比较对照组和环境化学物处理组的荧光值和搏动速率来分析环境化学物处理对心肌分化效率的影响；

(4)收集经过纯化后的对照组和处理组的心肌细胞，提取RNA，利用RNA-seq检测转录组表达水平，比较环境化学物处理组和对照组的基因表达差异；

(5)采用荧光定量PCR检测筛选出的关键心肌特异性差异基因的表达水平，验证环境化学物对心肌细胞分化的影响。

2.根据权利要求1所述的评价技术方法，其特征在于，所述步骤(1)具体方法为：将人胚胎干细胞系H9采用条件型培养基mTeSR1培养；后将H9细胞消化成单细胞，在mTeSR1中培养四天后，开始诱导分化；采用添加了GSK3抑制剂CHIR99021、不含胰岛素的RPMI/B27培养液培养，然后用不含胰岛素的RPMI/B27培养液培养；之后更换诱导液，用含有Wnt抑制剂IWR-1、不含胰岛素的RPMI/B27培养基培养，然后更换为不含胰岛素的RPMI/B27培养基继续培养；诱导分化的第7天开始，采用RPMI/B27培养液培养。

3.根据权利要求1所述的评价技术方法，其特征在于，所述步骤(2)中的低剂量为环境接触剂量或人群内暴露剂量；所述的暴露为连续暴露3周。

4.根据权利要求1所述的评价技术方法，其特征在于，所述的步骤(4)具体方法为：使用Qiagen RNeasy Mini Kit提取RNA；通过使用TruSeq RNA Library Prep Kit对RNA进行建库测序；测序后所得数据进行质控后，使用STAR 2.0进行序列比对，以H19作为参考基因组，进行转录组组装及数目计算；通过DEseq2比较处理组与对照组的基因表达差异。

5.根据权利要求1-3任一项所述的评价技术方法，其特征在于，所述环境化学物为三氯生。