[发明专利]一种鲟鱼显微注射的方法及应用

说明书

本发明公开了一种鲟鱼显微注射的方法及应用，在鲟鱼卵受精后的二十分钟内向鲟鱼1细胞期受精卵动物极的受精孔中进行显微注射，当质粒注射浓度为50‑100 ng/μL时，能同时保证基因转移的高成功率50‑70%，以及受体鲟鱼胚胎经显微操作处理后的高存活率83‑90%，利用该方法进行鲟鱼内源或外源基因编辑，也可获得高存活率和高突变率的胚胎，为开展鲟鱼基因的功能研究和鲟鱼养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种和功能基因验证研究的技术领域，更具体涉及一种鲟鱼显微注射的方法及应用。

背景技术

鲟鱼在生物系统演化方面处于软骨鱼和硬骨鱼之间的过渡时期，具有多倍化的基因组，在研究鱼类基因功能及演化方面具有重要的研究价值。但是，在鲟鱼中开展基因功能研究，现有的报道仅局限于基因克隆和表达模式分析(Abdolahnejad等，2015.Dong等，2015.Fajkowska等，2016.Song等，2016.Yarmohammadi等，2017)。鲟形目鱼类属大型经济鱼类。鲟鱼不仅肉质鲜美，营养全面，富含多种人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸，而且是重要的鱼子酱生产材料(Simeanu等，2012)。但是，由于人类过度捕捞及水生态环境的破坏，野生鲟鱼资源急剧下降，很多鲟鱼甚至处于濒危状态(Billard等，2000)。开展鲟鱼的遗传育种，培育鲟鱼养殖品种，是满足人类对鲟鱼产品日益增长的需求，保护野生鲟鱼资源的关键。但是，鲟鱼的基因功能研究和遗传改良育种一直受制于缺乏有效的技术手段。

显微注射法是进行鱼类基因转移或者编辑的经典方法，适合采用显微注射法的鱼卵具有卵壳柔软、透明，而且动物极清晰的特点。但是，鲟鱼受精卵的特点为黑色不透明，卵壳坚硬且受精后产生很强的粘性，难以酶解去除，存在不适宜进行胚胎显微操作的问题。

针对上述问题，本发明提供了一种鲟鱼显微注射的方法，可以利用该方法对鲟鱼进行基因转移，外源基因或者内源基因的精准编辑，为开展鲟鱼基因的功能研究和鲟鱼养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲟鱼显微注射的方法，方法简单，利用本发明的方法，可以成功实施基因的显微注射操作，获得的转基因鲟鱼的成功率高，存活率高。

本发明还提供了一种鲟鱼显微注射的方法的应用，包括利用该方法进行基因转移，进行鲟鱼的外源基因编辑或内源基因编辑。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲟鱼显微注射的方法，包括，在鲟鱼卵受精后的二十分钟内向鲟鱼1细胞期受精卵动物极的受精孔中进行显微注射。

以上所述的方法中，优选的，所述的鲟鱼包括但不限于小体鲟，西伯利亚鲟(A.baerii)、施氏鲟(A.schrenckii)、俄罗斯鲟(A.gueldenstaedtii)等。

一种鲟鱼显微注射的方法的应用，包括但不限于利用本发明提供的显微注射方法进行基因转移，鲟鱼的外源基因编辑或内源基因编辑。

以上所述的应用中，优选的，鲟鱼显微注射的方法在基因转移中的应用步骤包括，将包含有待转移目的基因片段的质粒，利用显微操作的方式注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极的受精孔中；

以上所述的应用中，优选的，鲟鱼显微注射的方法在鲟鱼的外源基因编辑中的应用步骤包括：在鲟鱼卵受精后的二十分钟内，将靶基因质粒和针对靶位点的TALEN mRNA，利用显微操作的方式注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极受精孔中；

以上所述的应用中，优选的，鲟鱼显微注射的方法在鲟鱼的内源基因编辑中的应用步骤包括：将Cas9蛋白与靶基因gRNA混合后，利用显微注射的方式，注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵的动物极受精孔中；

以上所述的应用中，优选的，每枚受精卵注射体积为2nL。