[发明专利]一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用。该重组工程菌是通过将突变脂肪酶的重组质粒经酶切线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将线性化的pAO815‑PDI重组质粒二次转化到带有突变脂肪酶基因的毕赤酵母GS115感受态细胞获得；所述的突变脂肪酶为脂肪酶5s或脂肪酶6s；其中，脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明中采取于毕赤酵母GS115中共表达分子伴侣PDI的策略，提供产量优化的耐热脂肪酶表达菌株，以缓解引入多对二硫键导致的表达水平较低的问题，特别适合在工业上进行应用。

技术领域

本发明属于酶工程领域，特别涉及一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)对中长链脂肪酸甘油三酯(C12～C16)具有较强偏好性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品加工、生物能源、化学合成以及胰腺缺乏症的治疗等多个领域，但其热稳定性较差限制了其应用。

二硫键能提高蛋白质的热力学和动力学稳定性，增强其刚性，对保持蛋白质的完整结构和生物功能具有重要作用。研究表明，在蛋白质中引入二硫键能大幅度提高其热稳定性，如木聚糖酶，纤维素酶和植酸酶等。在内质网中，蛋白质二硫键的正确形成是折叠的主要限速步骤之一。分子伴侣二硫键异构酶(PDI，Protein disulfide isomerase)能催化新生肽链二硫键的形成和异构化，纠正错误配对的二硫键，减少肽链的聚沉，加快肽链的折叠速度。内质网中错误折叠或未折叠的蛋白质过多时，将产生未折叠蛋白反应(UPR,Unfolded protein response)，该反应主要为IRE1(Inositol-requiring enzyme 1)介导的HAC1(The homologous to the activating transcript factor/cAMP-responseelement bingding protein)信号分子途径。HAC1分子的表达能上调折叠途径的分子伴侣(BiP和PDI等)以及分泌途径的分子伴侣的转录和翻译水平。通过采用共表达转录因子HAC1和分子伴侣PDI的策略，能显著提高外源蛋白与毕赤酵母的表达水平，已成功应用于人类单克隆抗体、人血清白蛋白融合蛋白、猪胰岛素前体和华根霉脂肪酶等。

本实验室已筛选出多对能提高Lip2耐热性能的单对二硫键突变体，改善其热稳定性，但其表达量明显下降。

目前较少研究关注引入较多二硫键导致的重组蛋白分泌下降问题，并缺乏对此进行优化的报道，因此很有必要缓解该问题，提高外源蛋白质的表达量。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌。

本发明的另一目的在于提供所述能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌的构建方法，采取于毕赤酵母GS115中共表达分子伴侣PDI的策略，以优化富含二硫键耶氏解脂酵母脂肪酶2耐热突变体的表达水平，最终提供种产量优化的耐热脂肪酶表达菌株，缓解目前引入二硫键导致的表达水平较低的问题。

本发明的再一目的在于提供所述能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌，是通过将突变脂肪酶的重组质粒经酶切线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，再将线性化的pAO815-PDI重组质粒二次转化到带有突变脂肪酶基因的毕赤酵母GS115感受态细胞获得。

所述的突变脂肪酶为脂肪酶5s或脂肪酶6s；其中，脂肪酶5s的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；脂肪酶6s的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的脂肪酶5s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的脂肪酶6s的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。