[发明专利]一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包括：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。本发明试剂盒检测方法操作简单、降低了检测成本，且灵敏性高、特异性强，可以应用于复杂样品的检测。并且本发明试剂盒还可应用于PNK活性抑制性检测中。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。

背景技术

多核苷酸激酶(PNK)是一种能够催化磷酸基团从ATP的γ位转移到DNA的5’-羟基末端进而生成5’-磷酸末端的DNA末端加工酶。这种PNK催化的磷酸化反应在DNA重组、DNA复制和DNA损伤修复等很多细胞过程中都发挥着重要的作用；PNK表达和活性异常与多种人类疾病密切相关；目前，PNK被认为是一种潜在的可用于癌症治疗的靶物质。

现有技术中，荧光检测方法因其便利性和灵敏性成为PNK活性检测最常用的方法。目前已有多种荧光检测方法用于PNK活性的分析测定，如：基于金纳米颗粒的荧光恢复检测法，基于免淬灭发夹型探针的荧光检测法，纸基荧光检测法，基于氧化石墨烯的分子信标荧光检测法以及基于催化活性分子信标组装的荧光检测法等。这些荧光检测方法在PNK活性的定量测定中都表现出良好的性能，但这些方法大多需要昂贵的荧光标记；同时由于不彻底的荧光淬灭效应还可能产生假阳性干扰。此外，因为缺乏有效的信号放大策略，这些方法的灵敏度普遍较低，多数方法的灵敏度还不足以支持实际应用。

与传统的聚合酶链式反应(PCR)及其他核酸扩增方法相比，指数扩增反应(EXPAR)具有恒定的反应温度、较高的扩增效率和较快的扩增动力学等显著优点。通过将DNA聚合酶介导的链延长反应和切刻酶介导的单链切刻反应结合起来，指数扩增反应(EXPAR)能够快速在恒定温度下实现106倍的信号扩增。指数扩增反应(EXPAR)最初被用于检测DNA，后来扩展到用于检测microRNA、端粒酶、转录因子和致病菌等其他靶物质。

发明内容

为了解决上述方法存在的问题，本发明提供了一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒，包括以下成分：探针A，探针S，混合液A，模板DNA，λ核酸外切酶，多核苷酸激酶标准品，1×NEBuffer和10mM三磷酸腺苷。

本发明第二个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)将探针A、探针S和1×的NEBuffer 2混合后在95℃下孵育5分钟，而后缓慢冷却30分钟以上至室温，得反应体系I；

(2)向上述反应体系I中加入三磷酸腺苷、λ核酸外切酶以及待测PNK于37℃孵育15～30分钟后，在70～80℃水浴中加热5～15分钟，缓慢冷却至室温，得反应体系II；

(3)将上述反应体系II置于冰上，加入模板DNA、10×NEBuffer 2混合均匀后加入混合液A，混合均匀后立即将混合液置于实时荧光定量系统中进行荧光监测。

本发明第三个方面，提供一种检测多核苷酸激酶的试剂盒在PNK活性抑制性检测中的应用。

本技术方案是基于磷酸化作用触发两级恒温指数扩增超灵敏检测PNK的免标记荧光定量方法。当体系中没有靶物质PNK存在时，无法引发任何扩增反应；反之，当靶物质PNK存在时，经过PNK催化的磷酸化作用和λ核酸外切酶的消化作用，探针在DNA聚合酶和切刻酶的作用下可以引发第一级链置换反应，产生大量的触发序列，进而启动第二级链置换反应，最终实现指数扩增，PNK的活性信号通过信号转换实现有效放大；最后利用SYBR green I染料作为荧光指示剂，可以轻松实现对荧光信号的免标记实时监测。