[发明专利]一种全细胞催化剂制备芳香醛和/或芳香醇的方法

说明书

本发明涉及一种全细胞催化剂制备芳香醛和/或芳香醇的方法，包括以下步骤：步骤一、基因工程菌的构建；步骤二、利用步骤一构建的基因工程菌制备全细胞催化剂；步骤三、通过温度控制步骤二获得的全细胞催化剂与肉桂酸衍生物反应生成芳香醛和/或芳香醇。进一步地，当反应温度＜40℃时，生成的芳香醇的量多于生成的芳香醛的量；当反应温度＞45℃时，生成的芳香醛的量多于生成的芳香醇的量，从而避免了对中温宿主中多个醇脱氢酶的敲除，为芳香生物基聚合物的生产开辟了新的技术，具有重要的现实意义和工业应用价值。本发明还涉及一种全细胞催化剂及其构建方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全细胞催化剂制备芳香醛和/或芳香醇的方法，以及该全细胞催化剂的构建方法。

背景技术

近年来，由于石化资源的限制和环境问题的日益凸显，生物基的聚合物得到越来越多的关注。通常，聚合物骨架中的芳香族单元(芳香醛/醇单体)可以提高聚合物的硬度、疏水性和防火性。芳香醇是碳链上连接有苯环的醇，芳香醛类物质则是指含有羰基的芳香族化合物，这类物质可以广泛用作聚合物单体、香料和激素等。比如有“香料皇后”美誉的香兰素，在食品、饮料、香精香料及医药领域中占据极为重要的地位，其年需求量已经超过了16,000吨。目前，作为芳香族单体，香兰素也越来越多的用于热固树脂和热固塑料的合成。然而，包括香兰素在内的芳香醛和芳香醇在植物中的含量非常低，分离和提取较为复杂，使得它们的产量极低，不能满足日益增长的需求量。化学法是合成芳香醛和芳香醇的主要途径，但这种方法依赖于石油化工产品和能源，并会对生态环境造成一定危害。

合成生物学和代谢工程的发展使得微生物发酵生产芳香醛和芳香醇成为现实，温和的反应条件、快速高效生产过程和清洁无污染等优势使得其成为最具潜力的芳香醛/醇制备方法。以香兰素为例，包括链霉菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌和肠杆菌在内的多种微生物可以转化不同底物生成香兰素，这些底物有阿魏酸、丁香酚、木质素、异丁香酚和香兰酸等。其中，肉桂酸衍生物阿魏酸是生物法制备香兰素最具潜力的底物，天然存在于一些可再生资源中，如谷糠、玉米麸、麦麸、甜菜等农副产物细胞壁，通过碱法或者酶法可以从这些资源中提取阿魏酸。然而，包括香兰素在内的芳香醛通常会被微生物中内源的多种广底物谱醇脱氢酶快速还原为相应的芳香醇。2000年，Li等人尝试利用诺卡氏菌的全细胞催化剂对苯甲基香草酸转化为对苯甲基香兰素，然而由于内源醇脱氢酶的作用，大多数产物被还原为对苯甲基香草醇。2009年，Hansen等人在酵母菌中构建了香兰素的从头合成途径，但在酵母内源醇脱氢酶的作用下，使得产物中副产物香草醇的量约为香兰素的2.5倍。因此，微生物内源的醇脱氢酶成为了微生物法制备芳香醛的瓶颈。

目前，有一些研究工作尝试对微生物内源的醇脱氢酶进行敲除，从而使得包括芳香醛在内的醛类物质得以积累。比如，2012年，Rodriguez等人对大肠杆菌中8个醇脱氢酶进行了敲除，使得异丁醛的产量从0.14g/L/OD₆₀₀提高到1.5g/L/OD₆₀₀,而异丁醇的产量从1.5降低到0.4g/L/OD₆₀₀。2014年，Kunjapur等人在大肠杆菌中敲除了六个醇脱氢酶，从而提高了香兰素和苯甲醛等芳香醛的产量。然而，对宿主微生物中多个内源酶的敲除是一个非常繁重的工作，会耗费大量的人力和资源。同时，宿主微生物中存在许多鉴定和未被鉴定的醇脱氢酶，准确定位到对目标产物起主要催化作用的酶并对它们进行敲除也是一个巨大的挑战。因此，需要开发一种新的方法来消除宿主的内源醇脱氢酶活性，避免繁琐的基因敲除步骤，从而使得芳香醛得以积累。过高的温度可以使得蛋白变性，从而使得相应的酶活丧失，这为宿主细胞内源醇脱氢酶活性的调节提供了一种新的思路。然而，目前并未有利用温度来控制包括香兰素等芳香醛/醇制备的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种全细胞催化剂制备芳香醛和/或芳香醇的方法。该方法避免了对宿主内源醇脱氢酶的敲除，可以直接利用温度来控制多种芳香醛和/或芳香醇的合成，极大的简化了生产过程，具有重要的现实意义和工业应用价值。

本发明的技术方案如下：