[发明专利]一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法

说明书

本发明属于基因转化方法技术领域，具体涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。包括以下步骤：外植体的准备；农杆菌的准备；外植体的一级共培养转化；诱导培养；愈伤组织的二级共培养转化；转基因植株的培养筛选等步骤。本发明综合考虑到蓝莓组织中纤维素等细胞成分基因转化过程的影响，对现有的农杆菌介导的基因转化方法进行改进，分别在幼嫩组织期和愈伤组织期进行农杆菌的共培养转化，基因转化成功率可达25.7％以上，且基因转化蓝莓幼苗分化成活率达99％以上，开发出了一种高效、快速、稳定的基因转化方法。

技术领域

本发明属于基因转化方法技术领域，具体涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。

背景技术

蓝莓属杜鹃花科，越桔属，果实呈深蓝色，球形或扁球形，直径约1cm，果皮薄，成熟果实呈蓝紫色，酸甜适口，可食性高。蓝莓果实中含有丰富的多糖、色素、果胶和保留遗传信息的DNA等物质。由于不同的蓝莓品种DNA之间存在差异，研究DNA与蓝莓表型之间的相互关系。转基因打破了不同植物物种之间的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的实现对生物体的改造。因此，选育出具有特殊性状或生理特性的转基因蓝莓品种是当前蓝莓育种的主要研究热点。

目前，常用的植物转基因方法包括载体介导法和DNA直接导入法，其中载体介导法又包括农杆菌介导法、病毒介导法。农杆菌介导法是目前双子叶植物常用的基因转移方法。它是利用携带有目的基因的农杆菌在植物形成肿瘤过程中可以将目的基因导入植物细胞中，进而构建出转化植株。虽然农杆菌介导的基因转化方法已经广泛应用于植物中，但是由于其操作步骤繁琐，浸染时间长，所以基因转化的成功率仅不到1％，效率不高。因此，开发一种高效快速稳定的蓝莓基因转化方法极为迫切。

发明内容

本发明提供的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，是一种简化的、可以减少多酚和色素干扰的蓝莓果实总DNA提取方法，能够避免色素对DNA纯度的影响。

本发明目的是提供一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：

S1，外植体的准备：切取蓝莓组织，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；

S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.4-0.8，培养温度为28±1℃，得到农杆菌菌液，备用；

S3，一级共培养转化：将无菌纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，150-220rpm、28±1℃暗室培养24-48h，得到一级转化处理组织；

每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、抗菌物质20-50mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；

S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养1-3周，得到愈伤组织；

S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养24-48h，得到二级转化处理组织；

S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；

所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基:黄原胶:抗菌物质＝1L:5-10g:20-50mg。

优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S1中，所述消毒液为0.5-1.5g/100ml的次氯酸钠溶液或者体积分数70％乙醇溶液；浸泡时间为20min。

优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S1中，所述蓝莓组织为蓝莓幼嫩茎或者蓝莓嫩叶。