[发明专利]一种解析植物内生细菌菌群的方法

说明书

本发明公开了一种解析植物内生细菌菌群的方法。本发明提供了用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3‑V4区的全长或部分；且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。本发明设计了一对引物322F‑1和796R，选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，共同实现了同时避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA两种序列污染的目的，从而获得了纯的细菌菌群16S扩增子文库。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种解析植物内生细菌菌群的方法，特别涉及一种利用引物对322F-1/796R解析植物内生细菌菌群结构的方法。

背景技术

自然条件下，植物的诸多器官内外都定殖着大量的复杂多样的微小生物，包括细菌、真菌、古菌、原生动物等等，它们影响着植物的生长发育和健康状态。在这些微小生物中，细菌在数量上占绝对优势，按照这些细菌定殖在植物组织的表面或者内部，它们被分为两类，分别叫做植物表面菌群和植物内生菌群。

植物内生菌的研究方法有培养法和非培养法两类，借助于16S rDNA扩增子测序的二代测序是是非培养法中经典研究方法，也是目前应用最普遍的一种方法。细菌的16SrDNA由10个序列保守区和9个序列高变区交替排列组成，保守区序列在不同的细菌中几乎是一致的，而高变区则具有物种特异性，因此，16S rDNA是公认的细菌分类鉴定的分子钟。应用上，可以根据16S rDNA的的序列保守区设计一对引物，扩增出含有几个高变区的序列片段，然后根据高变区的序列特异性进行菌种的分类鉴定。基于此原理，借助于16S rDNA扩增子测序的二代测序被发展起来，并广泛应用与动植物菌群的多样性解析。

对于植物内生菌群的解析，由于植物的叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA与细菌的16S rDNA有很高的同源性，导致16S扩增子文库中会出现极高比例的宿主DNA污染，严重干扰后续的多样性分析。

目前，为了实现通过16S扩增子测序方法解析植物内生菌群的目的，急需设计合适的扩增引物及可行的扩增方案来避开宿主植物DNA的污染从而获得纯的菌群16S扩增子，从而为植物内生菌群的解析提供测序实验平台。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于解析植物内生细菌菌群的引物对。

本发明提供的引物对，其靶序列为细菌16SrDNA的V3-V4区的全长或部分(与细菌16SrDNA完全相同)；

且所述引物对中的一条引物与植物线粒体18SrDNA中区域甲对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域甲中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域甲的差异位点大于等于3个；

所述区域甲与所述一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均相同或互补；

所述引物对中的另一条引物与植物叶绿体16S rDNA中区域乙对应，且该引物3’末端最后一个碱基与所述区域乙中最后一个碱基有差异，且该引物与所述区域乙的差异位点大于等于3个；

所述区域乙与所述另一条引物的区别在于除了差异位点外其余碱基均互补或相同。

且所述引物对中的一条引物3’末端最后一个碱基与植物线粒体18SrDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个；另一条引物3’末端最后一个碱基与植物叶绿体16S rDNA有差异，且该引物全长与植物线粒体18SrDNA的差异位点大于等于3个。

上述引物对中，所述引物对由引物1和引物2组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列1；