[发明专利]一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法

说明书

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种Aβ42修饰蛋白及其在大肠杆菌中的表达及纯化方法。本发明构建的Aβ42表达体系提供了原核生物表达人淀粉样蛋白Aβ42表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导表达、两步纯化及鉴定后获得具有高纯度生物活性的目标Aβ42‑His蛋白。本方法所采用的大肠表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所获得的Aβ42多肽含有His标签方便纯化，且纯度高、产率高，比化学合成Aβ42具有更好的聚集特性和细胞毒性等优点。

技术领域：

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种利用大肠杆菌表达系统表达并纯化制备高纯度人淀粉样蛋白Aβ42修饰蛋白的方法，具体为重组大肠杆菌表达载体的构建及转化方法、蛋白诱导表达及纯化方法。

背景技术：

淀粉样蛋白聚集成不溶性的淀粉纤维可导致各种神经性疾病，例如阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病。这种疾病严重影响着世界上数以百万计的老年患者。据国际阿尔茨海默病协会2016年公布的数据，2015年全球约有4680万AD患者，且其数量以20年翻一番的速度递增，预测2050年全球将有1.3亿AD患者。由于AD病程长(约10年)且患者生活需要护理，因此医疗和护理花费惊人。2015年全球AD患者的医疗花费约为8180亿美元，占全球GDP的1.1％。因此该疾病的病因和寻找抗AD药物成为世界范围内研究人员关注的焦点。

淀粉样蛋白斑(AD患者大脑中老年斑的主要成分)，主要是由淀粉样β-蛋白(Aβ)聚集形成的，主要含有39-43个氨基酸。Aβ主要是通过一个含695-770个氨基酸组成的淀粉样前体蛋白APP通过β-和γ-分泌酶水解而成，但该前体蛋白的生物功能目前尚不清楚。据报道，Aβ42是大脑中老年斑的主要成分之一。尽管目前对纤维形成过程中的聚集体的研究，已经取得了较大的进展，但很多关于这些聚集体的大小、结构、形态以及与细胞毒性之间的关系等方面目前仍存在很多未知的问题。

目前许多基于抑制Aβ42多肽聚集进行抗AD药物的设计和筛选，为探索其聚集机制和毒理学性质，首先需要获得高纯度Aβ42。该多肽分子量大小约为4.5kDa，含有胞外和跨膜结构域。目前Aβ多肽主要通过固相化学合成法(SPPS)制备，然而SPPS合成过程中残留的氨基酸或多肽片段均严重影响了Aβ的聚集和毒理特性。由于Aβ42自身存在高疏水性和易于聚集的特性，很难从神经细胞组织中提取和纯化，因此难以获得大量高纯度的多肽。

基因工程方法具有能够大量生产Aβ的优势，目前已有一些研究组设计出一些表达系统，并表达纯化获得重组Aβ，然而由于Aβ的高疏水性和聚集体具有较高的细胞毒性，利用传统的大肠杆菌表达系统依然存在表达量低、纯化步骤复杂、获得Aβ纯度不高等缺点。利用可溶性蛋白与Aβ融合表达来增加其溶解性和稳定性可解决上述制备Aβ的缺点，然而通过该方法获得含有Aβ融合蛋白，后续还需通过蛋白酶酶切去除融合蛋白，该方法不仅纯化过程繁琐复杂，还会造成大量蛋白的损失。

pET22b表达载体是常用的大肠表达载体之一，载体上含有T7启动子，该启动子为强诱导型启动子，具有较好的选择特异性和活性。经诱导后几乎能启动转录细胞内所有类型基因，且能够极大提高插入基因片段的表达量。另外pET22b表达载体多克隆位点C端自带His标签，为后续目标蛋白的纯化提供便利。

为了解决上述问题，本发明将提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化方法，以获得高产、高纯度的Aβ42多肽，该多肽具有更强的聚集特性和细胞毒性，可替代目前研究中广泛使用的化学合成的Aβ42多肽。

发明内容：

为了实现上述目的，本发明提供一种简易的高纯度Aβ42修饰蛋白及其在大肠杆菌中的表达及纯化方法。