[发明专利]利用蓝藻黄素蛋白FNR直观检测目的蛋白表达纯化的方法

说明书

本发明公开了一种利用蓝藻黄素蛋白FNR直观检测目的蛋白表达纯化的方法，首先构建目的蛋白基因与蓝藻fnr基因或其同源基因的融合基因，并将含该融合基因的表达载体转入表达菌种中进行表达，通过观察表达菌液破碎后的上清液和/或其纯化组分的颜色来判断融合蛋白是否被成功表达和/或纯化，如果上清液和/或纯化组分偏黄色，说明目的蛋白与蓝藻FNR蛋白或其同源蛋白一起被表达和/或纯化。该方法实现了对目的蛋白表达纯化的直观检测，方便快捷。

技术领域

本发明涉及一种直观检测目的蛋白表达和纯化的方法，特别涉及一种利用蓝藻显黄色的蛋白——铁氧还蛋白还原酶FNR来直观检测目的蛋白表达和纯化的方法。

背景技术

FNR(Ferredoxin-NADP⁺reductases)，也叫铁氧还蛋白还原酶，是一种在生物体的多种代谢中起着重要作用的黄素酶。FNR能催化NADPH与铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fd)或铁硫蛋白之间的可逆反应。FNR在多种代谢过程的电子传递中起控制作用。它含有一分子非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅基，通过自身结合的FAD在不同的还原电势反应中进行单电子或双电子的传递。在植物(如豌豆、菠菜、小麦等)和蓝藻的光合作用中，FNR参与光合电子传递，在光系统Ⅰ中还原Fd并将电子转移给NADP⁺，从而提供必要的NADPH用于CO₂的固定。我们研究发现在大肠杆菌中重组表达的蓝藻中FNR蛋白显黄色。

目的蛋白在原核系统中的表达和纯化是分子生物学研究和生物技术产业化发展过程中的重要工具，是对目的蛋白功能和性质研究的基础，更促进了现代生物学科迅猛发展。在各种版本的分子生物学实验指南中，目的蛋白的表达和纯化的基本流程是：1、将目的基因克隆入合适的表达载体后导入原核细胞表达系统菌株；2、诱导表达菌株表达目的蛋白；3、通过目的蛋白所带的融合标签如GST、His等，选择不同性质的柱料将目的蛋白与其它蛋白分离，从而达到纯化目的蛋白的目的。

然而，目前没有直观实时检测目的蛋白的表达纯化情况的方法。根据目前主流的实验技术，无论先小量诱导检测目的蛋白是否表达，还是最后检测是否通过柱料得到了纯化了的目的蛋白，都需要将蛋白样品通过十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后用蛋白染色的方法来检测目的蛋白的表达纯化情况。SDS-PAGE检测蛋白样品需要将蛋白样品制样，配置聚丙烯酰胺凝胶，然后跑大约1个小时的蛋白电泳，最后还需要将蛋白染色才能最终知道目的蛋白是否已经表达或者得到纯化，这些检测需要额外的步骤和时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种直观实时检测目的蛋白表达和纯化的方法，以解决目前体外表达纯化的目的蛋白需要通过SDS-PAGE来检测、需要大量额外的时间来进行实验操作和其它实验试剂的配制，并且不能实时直观检测的技术问题。本发明通过将目的蛋白与蓝藻色素蛋白融合表达来检测目的蛋白的表达和纯化情况，提供了一条便捷直观的方法。

为解决上述技术问题，本发明将目的蛋白与蓝藻黄素蛋白FNR或其同源蛋白融合表达，由于FNR蛋白非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)呈现黄色，所以整个融合蛋白也呈现黄色。通过观测融合蛋白的颜色来判断目的蛋白是否已经成功表达和/或纯化，从而构建了一种直观实时检测目的蛋白表达纯化的便捷方法。具体的，本发明的技术方案如下：

一种直观检测目的蛋白表达纯化的方法，构建目的蛋白基因与蓝藻fnr基因或其同源基因的融合基因，并将含该融合基因的表达载体转入表达菌种中进行表达，通过观察表达菌液破碎后的上清液和/或其纯化组分的颜色来判断融合蛋白是否被成功表达和/或纯化，如果上清液和/或纯化组分偏黄色，说明目的蛋白与蓝藻FNR蛋白或其同源蛋白一起被表达和/或纯化。

进一步的，在对表达的融合蛋白进行柱纯化的过程中，通过观察柱料是否变为黄色可以判断目的蛋白是否结合上柱料。