[发明专利]一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞检测领域，特别涉及一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒及方法。

背景技术

肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称之为肿瘤干细胞，其被认为是造成恶性肿瘤复发的主要原因，因此肿瘤干细胞的研究是当今肿瘤领域的热点。现有的肿瘤干细胞检测手段复杂、效率低，有的甚至对细胞有毒性。如：传统的细胞表面标志分子如CD133,CD44，CD24等可用来分离鉴定某些肿瘤的肿瘤干细胞，但是这类标志分子常常需要将几种标志分子组合在一起使用，并且这类标志分子不是肿瘤干细胞通用的标志分子。Hoechst 33342也可以用来分离疑似肿瘤干细胞的侧群细胞，但Hoechst 33342染色对细胞具有毒性，且某些肿瘤中的侧群细胞并不能代表肿瘤干细胞本身。

干细胞、祖细胞和肿瘤干细胞均表达较高的乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，缩写ALDH)活性，高ALDH活性被认为几乎是所有肿瘤干细胞的通用标志。因此找到一种细胞内ALDH活性的检测方法，对肿瘤干细胞检测领域的研究有推动作用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒和方法，使用该试剂盒和方法进行检测对细胞无伤害，且使得检测中流式细胞仪的背景荧光强度更低、便于使用者辨认且灵敏度更高，能够用于干细胞、祖细胞和肿瘤干细胞的研究中。

在本发明提供的技术方案中BAAA-DA是BODIPY-aminoacetaldehyde diethyl acetal(即：BODIPY-氨基乙醛缩二乙醇)的缩写；BAAA是BODIPY-aminoacetaldehyde(即：BODIPY-氨基乙醛)的缩写；BAA是BODIPY-aminoacate；DEAB是Diethylaminobenzaldehyde(即：二乙氨基苯甲醛)的缩写；其中BODIPY是氟硼二吡咯类荧光染料。

本发明提供了一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒，包括以下组分：BAAA-DA溶液，DEAB溶液和试验缓冲液；所述BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为0.6-1.2g/L；所述DEAB溶液中DEAB的浓度为1.2-1.8mM；所述试验缓冲液是含有ABC transportor抑制剂和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中ABC transportor抑制剂的浓度为45-55μM，牛血清白蛋白的浓度为0.8-1.2％。

上述试剂盒在另一种可能的实现方式中，还包含HCl。

本发明还提供了一种检测细胞内ALDH活性的方法，包括以下步骤：

1)用试验缓冲液将样品细胞稀释成细胞浓度为(0.8-2)×10⁶个/ml的单细胞悬液，优选为1×10⁶个/ml的单细胞悬液；

2)为每个待检测的样品细胞取出两个流式检测管，其中一个流式检测管作为检测管，另一个流式检测管作为对照管，试剂的加入方式为：

A、在检测管中加入1ml步骤1)所得单细胞悬液；之后向检测管中加入5μL活化稀释好的BAAA-DA溶液，混匀；

向对照管中加入5μL DEAB溶液；

B、将0.5ml步骤A所得混合液立即转移至已加入DEAB的对照管中混匀；

3)将检测管和对照管在37℃孵育30-60分钟；

4)将检测管和对照管离心，除去上清，将细胞沉淀重悬于0.5ml试验缓冲液中，冰上或者4℃存放；

5)对经过上述处理的样品细胞进行流式细胞仪检测；

其中：所述BAAA-DA溶液中BAAA-DA的浓度为0.6-1.2g/L；所述DEAB溶液中DEAB的浓度为1.2-1.8mM；所述试验缓冲液是含有ABC transportor抑制剂和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中ABC transportor抑制剂的浓度为45-55μM，牛血清白蛋白的浓度为0.8-1.2％；所述活化稀释好的BAAA-DA溶液是指在浓度为0.6-1.2g/L的BAAA-DA溶液中加等体积的盐酸混匀并室温静置12-18分钟进行活化，优选15分钟，再加入6-6.5倍体积的试验缓冲液进行稀释并混匀所得，优选6.2倍体积。