[发明专利]一种删除转基因大豆筛选标记的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物，具体地说，涉及一种删除转基因大豆筛选标记的方法。

背景技术

大豆原产中国，是世界上重要油料作物之一。大豆是最早开展转基因研究的作物之一。据报道通过转基因技术已成功转入了抗旱、抗除草剂、抗病虫、耐盐碱等基因，为培育具有优良性状的转基因大豆新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因大豆的推广应用。

目前，转基因技术可能存在的潜在安全风险问题受到公众的广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。选择标记基因是目前阻碍转基因植物发展的因素之一。选择标记基因编码一种正常植物细胞不存在的酶，能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。其功能是在某种选择压力下，将转化体筛选出来。常用的选择标记基因包括抗生素基因和除草剂基因。抗生素基因主要包括nptⅡ、cat、spt等；除草剂抗性基因有抗草丁膦和双丙膦的bar和pat及抗草甘膦的epsps基因等。这些选择标记基因虽然方便、廉价，但是，当获得转基因植株后，筛选标记基因就失去价值，其继续表达的产物也会带来安全隐患，从而引起人们转基因植物安全问题的担忧，极大地阻碍了转基因作物商业化的发展。国内外大量的学者认为删除选择标记基因是必要的。综合以上情况，消除选择标记，培育无选择标记的转基因植物，对推动转基因作物的商业化发展意义重大。当前用于剔除筛选标记基因的方法有共转化法(co-transformation)、位点特异性重组法(site-specific recombination)、转座子法(transposon)、染色体同源重组法(intra-chromosomalrecombination)。例如张秀春(2006)利用双T-DNA载体、叶兴国(2007)利用三T-DNA载体转化方法获得无筛选标记转基因大豆，标记基因删除效率分别为5.6％和7.6％。

目前位点特异性重组是删除选择标记基因的一种有效途径，已经广泛应用于不同植物的转基因体系中。其中来自噬菌体P1的Cre/LoxP系统在所有位点特异性重组系统中应用的最广、最完善、具有较高可控性的转化系统。其原理如下：Cre/lox P位点特异性重组系统中的Cre重组酶专一性地识别由34个碱基对组成的特异序列(lox P位点)，使2个lox P位点片段发生重组，2个lox P位点之间的基因或DNA序列从而被剔除。李茂福等(2016)构建载体的Cre受热激启动子调控，对转基因植株进行37℃热激处理3d获得无选择标记转基因苹果植株(李茂福等，loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得[J].园艺学报，2016，(02):205-217.)。Zuo等(2000)构建了一种化学诱导与特异性位点重组相结合的高效DNA切除载体PX6-GFP，在PX6-GFP载体中，cre基因的表达受“雌激素受体反式激活因子”XVE的严格控制，而XVE受β-雌二醇诱导。PX6-GFP将“loxP-XVE-nptII(标记基因)-Cre-loxP”三个串联的转录单元位构建于2个lox P位点之间。因此，当用β-雌二醇诱导XVE表达后，cre被XVE激活，Loxp序列之间的3个转录单元被剔除。Zuo等在转基因操作的拟南芥芽诱导的培养基中添加β-雌二醇(2μmol/L)，诱导cre酶表达，删除了标记基因(Zuo J，Niu Q W，Moller S G，et al.Chemical-regulated，site-specific DNA excision in transgenic plants.[J].Nature Biotechnology，2001，19(2):157-161.)。