[发明专利]一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种四环素抗性细菌的检测方法，尤其是涉及一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法。

背景技术

近年来由于抗生素的大量使用，环境中抗生素的存在水平相较于20世纪已有显著提高，由此导致的抗生素环境污染和生态毒害问题也日趋严重。目前，不同种类的抗生素已经在地下水、饮用水、地表水和农业土壤中被广泛检出。四环素是环境中最为常见的抗生素之一。进入环境中的抗生素不仅会干扰环境中其他生物的正常代谢及生长，还能诱发大量抗生素抗性细菌的产生。

抗生素抗性细菌(Antibiotics Resistance Bacteria，ARB)对抗生素产生抗性是因为具有抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes，ARG)，而ARG在水中可以通过水平基因转移等方式转移到其他细菌体内，从而使其他细菌也具有对抗生素的抗性。一些研究已经证实饮用水中存在多种条件致病菌，一旦这些细菌通过水平基因转移等方式获得了抗生素抗性，再通过饮用水处理系统进入人体，将会对人体健康造成极大威胁。因为抗生素抗性的获得意味着普通的抗生素将会很难将这些细菌杀死，从而对现有的医疗卫生手段提出了极大的挑战。因此，对饮用水中的抗生素抗性细菌数量进行检测非常必要。

传统的抗生素抗性细菌检测方法是利用特定培养基将抗生素抗性细菌分离出来再进行计数。一般来说是在R2A培养基中加入等于抗生素MIC值的抗生素，再经过稀释平板法统计菌落数量。传统培养法的缺陷在于有一些抗性细菌本身是不可培养的细菌，不能在培养基上生长出菌落，从而无法被计数。而且传统培养法需要花费大量人力，检测周期也较长，不能快速准确地检测水中抗生素抗性基因的数量。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，包括以下步骤：

(1)取待测水样加入棕色试管中，加入四环素母液，使待测水样中四环素浓度等于其MIC值，再将其置于培养箱中，在27℃下培养24h；

(2)取培养后的水样转移至流式细胞仪进样管中，加入SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂染色，充分震荡后37℃下避光培养10～15min；

(3)再将培养后的流式细胞仪进样管转移至流式细胞仪中，开始进样，并测定活细胞数，即四环素抗性细菌数，将测出的四环素抗性细菌数除以进样体积，即得到饮用水中四环素抗性细菌的浓度。

作为优选的实施方案，根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)所规定的四环素的最小抑制剂浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)为16mg/L，配制四环素母液，加入500mL超纯水和0.8g四环素，使四环素浓度为1.6g/L，避光保存。需使用时，可以通过四环素母液与原水样配置得到待测水样。

作为优选的实施方案，步骤(1)中当待测水样中细菌浓度过高时，可采用稀释剂稀释，所述稀释剂为磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，其配方为：34g磷酸二氢钾，175ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，825ml超纯水，pH＝7.2。

作为优选的实施方案，步骤(2)中SYBR Green I染色剂的加入量为5μL/500μL水样，碘化丙啶染色剂(此处为纯碘化丙啶)的加入量为1.5μL/500μL水样。

作为上述优选的实施方案的更优选，所述的SYBR Green I染色剂通过以下方法制成：

取SYBR Green I染料置于灭菌后的离心管中，再加入二甲基亚砜稀释，制成SYBR Green I工作储备液，置于-20℃冰箱中保存备用，使用时将SYBR Green I工作储备液取出融化并震荡均匀。

作为上述更优选的实施方案的进一步优选，SYBR Green I染料与二甲基亚砜的体积比为1:99，其中，二甲基亚砜预先采用0.22μm滤头过滤处理。

作为优选的实施方案，步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm(20MW)，进样速度为中速，通道电压等参数根据实际需求调整；