[发明专利]一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法

权利要求书

1.一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测水样加入棕色试管中，加入四环素母液，使待测水样中四环素浓度等于其MIC值，再将其置于培养箱中，在27℃下培养24h；

(2)取培养后的水样转移至流式细胞仪进样管中，加入SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂染色，充分震荡后37℃下避光培养10～15min；

(3)再将培养后的流式细胞仪进样管转移至流式细胞仪中，开始进样，并测定活细胞数，即四环素抗性细菌数，将测出的四环素抗性细菌数除以进样体积，即得到饮用水中四环素抗性细菌的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(1)中当待测水样中细菌浓度过高时，可采用稀释剂稀释，所述稀释剂为磷酸盐缓冲溶液，其配方为：34g磷酸二氢钾，175ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，825ml超纯水，pH＝7.2。

3.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(2)中SYBR Green I染色剂的加入量为5μL/500μL水样，碘化丙啶染色剂的加入量为1.5μL/500μL水样。

4.根据权利要求3所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述的SYBR Green I染色剂通过以下方法制成：

取SYBR Green I染料置于灭菌后的离心管中，再加入二甲基亚砜稀释，制成SYBR Green I工作储备液，置于-20℃冰箱中保存备用，使用时将SYBR Green I工作储备液取出融化并震荡均匀。

5.根据权利要求4所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，SYBR Green I染料与二甲基亚砜的体积比为1:99，其中，二甲基亚砜预先采用0.22μm滤头过滤处理。

6.根据权利要求1所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm(20MW)，进样速度为中速；

检测时，SYBR Green I染色细胞在533nm绿色荧光FITC-A通道通道下检测，PI染色细胞在670nm红色荧光7AAD-A通道通道下检测，当检测的总的events数为300000时，停止进样，并记录进样体积。

7.根据权利要求6所述的一种饮用水中四环素抗性细菌的流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述的四环素抗性细菌数通过以下方法测出：

(a)取流式细胞仪进样管中加入超纯水、SYBR Green I染色剂和碘化丙啶染色剂，作为空白对照样，再置于流式细胞仪中测定，输出二维点图作为参照图样，参照图样中45°方向形成杂质聚团；

(b)水样检测时，流式细胞仪同样输出结果并得到二维点图，依参照图样选定45°方向的散点聚团为杂质聚团，在杂质聚团的左右两侧，即FITC-A通道荧光强度稍强处(>10²)以及7AAD-A通道荧光强度稍强处(>10²)分别另有散点聚团，圈定位于右下方的活细胞区域，计算出活细胞区域内所占百分数，再乘以总的event数300000，即可得到四环素抗性细菌数。